TNBS诱导的结肠炎对成年斑马鱼肠道神经元亚群的影响｜环特生物斑马鱼研究

核心摘要

炎症性肠病 (IBD) 包括胃肠道(GI)的炎症，其特征是急性炎症和缓解期。 IBD 的治疗管理仍然存在问题，因为对其发病机制了解不完全。这项研究的重点是2,4,6-三硝基苯磺酸 (TNBS) 诱导的结肠炎对成年斑马鱼肠道神经元亚群变化的影响。

这些变化被认为与改变的神经免疫相互作用和 GI 运动性以及 IBD 发病机制有关。对神经可塑性的新见解将有助于寻找合适的治疗方法。在麻醉的成年斑马鱼的远端肠 (DI) 中腔内注射 TNBS。创建肠道炎症反应的组织学时间过程，以建立很好的TNBS 浓度和急性炎症阶段。在整个装载上使用双重免疫标记，分析了炎症对神经元群的影响。基于肠壁增厚、上皮褶皱破坏、杯状细胞数量减少和嗜酸性粒细胞浸润，我们的分析表明，诱导非致死性炎症的很好的TNBS 浓度（320 mM，溶于 25% 乙醇）在诱导后 6 小时达到峰值。

炎症反应在诱导后 3 天恢复到基线值。在急性炎症阶段，未观察到对氮能神经元分布或比例的影响，而仅胆碱能神经元比例在 DI 中显著降低。炎症期间整个肠道中5-羟色胺能神经元的比例显著增加。本研究描述了 TNBS 诱导的成年斑马鱼结肠炎的方法。鉴于急性炎症阶段伴随着与IBD患者观察到的变化相当的神经可塑性，以及斑马鱼的独特和多功能特征，允许该模型与IBD动物模型一起使用，以解开IBD病理学并测试新的IBD疗法。

一、引言

炎症性肠病 (IBD) 的特征是胃肠道(GI)内的慢性免疫激活和炎症，处于急性炎症和缓解期。克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)是IBD的两种主要表型。 近年来，大量有关IBD的知识被揭示出来。然而，IBD的发病机制仍未完全了解。到目前为止，我们所知道的是遗传、环境、微生物和免疫因素之间存在复杂的相互作用。患者会出现痉挛、大便急迫、腹泻、腹痛和体重减轻。众所周知，IBD或GI炎症会影响GI功能，包括运动、分泌、吸收、肠道屏障功能和感觉。

胃肠功能由自主神经系统控制，包括肠神经系统(ENS)。ENS由存在于胃肠道壁内的所有神经元组成，并分为两个主要的神经丛，肌间神经丛和粘膜下神经丛。ENS包含一组不同的功能神经元类型，包括感觉神经元、中间神经元和运动神经元，它们在微电路中以突触方式相互连接。先前在动物模型和患者中的研究结果表明，炎症会导致结构和结构变化，包括神经变性，在肠神经节和神经丛中，并改变ENS中神经递质、神经肽和受体的表达。

尽管结肠炎的动物模型并不能完全模拟人的IBD，但通过使用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的动物结肠炎，已经获得了有关IBD病理生理学的大量数据。

近年来，斑马鱼越来越多地用于揭示人类疾病模式—包括IBD。斑马鱼作为模式生物具有一些独特的特征，例如，大量的后代、较低的维护成本、完全测序的基因组、大量可用遗传工具、易于控制的环境以及先天性和适应性免疫反应的存在。已经在幼虫和成年斑马鱼中进行了类似于小鼠的基于化学的结肠炎诱导实验，使用浸泡、口服微灌胃或直肠内给药。随后的免疫反应、遗传因素和环境因素似乎与在哺乳动物小肠结肠炎动物模型中观察到的相似。这些研究在表明小肠结肠炎的诱发取决于特定的微生物环境，每个实验室都必须优化自己的TNBS模型。本研究侧重于TNBS诱导的结肠炎对成年斑马鱼ENS的影响。不同肠道神经元群内的变化被认为与神经免疫相互作用和胃肠动力的改变有关，甚至与IBD的发病机制有关。更好地了解神经可塑性将有助于寻找合适的治疗方法。

斑马鱼的肠道只有一个由分散的肠神经元组成的非神经节肌间神经丛，没有黏膜下神经丛。斑马鱼没有胃，但近端肠(PI)是储存和混合食物的场所。接下来是中肠（MI)含有产生粘蛋白的杯状细胞和肠细胞，主要用于营养吸收。MI的远端部分包含一些假定在肠道免疫中起作用的特化肠细胞。短远端肠(DI)的结构表明其作用类似于哺乳动物中的结肠。以前的研究表明，成年斑马鱼肠道中存在不同的神经元亚群，可分为三类：5-羟色胺能、胆碱能和氮能神经元。

本研究的目的是通过确定很好的剂量和炎症的急性期来优化我们实验室条件下成人TNBS诱导的结肠炎模型，并调查斑马鱼肠道中存在的主要肠道种群的假定神经元变化。

二、成年斑马鱼小肠结肠炎的诱导

雌性斑马鱼（6-8个月）在0.016% MS222（甲基氨基苯甲酸乙酯；Western Chemical Inc.,Ferndale,WA,USA）中麻醉3分钟，称重、测量并放置在湿纸巾上。

腹部被轻轻挤压以增强直肠开口的可视化。使用外径为0.3 mm的Eppendorf GELoader（Eppendorf AG，Hamburg，Germany）柔性尖端将适当体积（10 μL/g体重）的注射进鱼直肠。为了评估很好的剂量，给鱼注射了溶解在25%乙醇中的不同浓度的TNBS（Sigma-Aldrich Corp.,St.Louis,MO,USA）：5 mM、40 mM、80 mM、160 mM、320 mM和640 mM，随后单独放置在通风良好的独立罐中，用于个体观察和生存分析。

对照组包括仅接受25%乙醇（10 μL/g体重）的载体组和仅接受操作程序的处理组（对照组）。这部分研究中的每个实验组总是包含15条成年斑马鱼，而两个对照组各包含5只动物。

6小时后，斑马鱼在0.04%MS222中安乐死，并分块解剖胃肠道。将肠在含10 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH 7.4）的4% 多聚甲醛(PFA)中固定过夜，并在PBS中冲洗后，进一步加工以包埋在石蜡中。由MI的后部和DI在HM340E切片机（Microm，Walldorf，Germany）上制成7 μm的连续切片。

先前已证明成年斑马鱼胃肠道的后部在基于化学的小肠结肠炎诱导中受到影响。交替处理切片以进行标准苏木精和伊红(H&E)染色，以显示肠壁的一般形态，或用于阿尔新蓝/高碘酸席夫(PAS)反应检测产生粘液的杯状细胞和浸润的嗜酸性粒细胞。使用Olympus DP70相机（Olympus Belgium NV,Aartselaar,Belgium）对每个分析的切片进行拍照。检查了四个不同的参数：肠壁的厚度、上皮褶皱结构、杯状细胞的数量和嗜酸性粒细胞的浸润。使用Image J(NIH, Bethesda, MD)分析图片。

在每条鱼的12个切片中测量肠壁的厚度。计算平均值（以μm为单位）并根据其增厚进行细分，范围从0到2（0 =无增厚，≤75 μm；1 =中等增厚，75-95 μm；2 =严重增厚，≥95 μm）。上皮褶皱的结构外观根据三类在每只动物的12个切片中进行评级：0（正常外观）、1（轻微破坏）或2（严重破坏：增加的褶皱间距和上皮完整性的破坏）。

在每条鱼的16个切片上计算杯状细胞的数量（1个框架/切片：一个框架的表面积：0.13 mm2）。计算平均值并分配一个分数：0 = ≥15个杯状细胞；1 = 10到15个杯状细胞；2 = ≤10个杯状细胞。在同一帧上，根据以下评分系统对嗜酸性粒细胞的浸润进行计数：0 =几乎没有任何嗜酸性粒细胞存在；1 =中等渗透；2 =严重浸润，特征为滤过细胞簇。将0至8分的四个分数相加，得出小肠结肠炎总体评分，0至2分表示无炎症，3至5分表示中度炎症，6至8分表示严重炎症。为了确定炎症的急性期，斑马鱼注射了很好的剂量的TNBS，并在3、6和14小时、1、3和7天后安乐死。如上所述，将肠切出并进行石蜡切片和染色处理。本部分每个实验组和对照组各有5条成年斑马鱼。

三、神经元群

为了确定神经元群可能发生的变化，在炎症的急性期进行了全肠道准备。因此，将肠沿肠系膜边界打开并固定在装有4% PFA PBS的Sylgard-lined培养皿中，室温下放置2小时。固定后，整个支架在PBS中彻底清洗，并进一步处理以获得很好的免疫染色，如前所述。简而言之，在PBS中漂洗后，将整个支架在含有0.05%硫柳汞的PBS中孵育1小时。接下来，在PBS中洗涤后，将它们浸入含有0.1%NaBH-CN的PBS中30分钟并在PBS中冲洗。如前所述，在室温下对整个安装制剂进行双重免疫染色。使用的初级和二级抗体列于表1中。

嵌入整个支架后，使用配备Olympus DP70相机的荧光显微镜拍摄图像。为了研究小肠结肠炎对肠神经元群的影响，我们对每个群使用了5只动物，而两个对照组都包含3只动物。如前所述，肠道被任意分成三部分：PI、MI和DI。在每个部分，对10个随机选择的区域进行拍照，并如前所述手动计数细胞。为了定量，每个视觉框架(8.2x104 μm2)对免疫反应性细胞体进行计数。所有统计检验均使用IBM SPSS Statistics 20（IBM，Armonk，NY，USA）进行。结果通过方差分析进行分析，然后在适当时进行Tukey事后检验。假设显着性为P<0.05。共聚焦图像是使用PerkinElmer UltraVIEW Vox旋转圆盘共焦系统使用488和 561 nm激光器拍摄的。

表1 一抗和二抗列表，以及它们各自用于免疫组织化学的稀释度

四、结果

1、剂量反应

测试了不同的TNBS浓度以找到用于进一步实验的很好的剂量。接受5至160 mM剂量的鱼没有死亡（截止6小时），也没有表现出严重的不适。然而，使用更高的TNBS浓度，我们观察到接受320 mM TNBS的鱼有73%存活，而分别接受480 mM和640 mM TNBS的鱼只有55%和25%存活（图1）。注射了480 mM和640 mM TNBS的鱼遭受了剧烈的疼痛，使用这些剂量的进一步实验被排除在研究之外。此外，在两个对照组中均未观察到高疼痛评分或死亡。

对诱导后6小时(hpi)收集的样品的不同组织切片进行评分显示，浓度为40、80和160 mM时出现中度炎症，而注射320 mM TNBS导致严重炎症（图2）。炎症导致肠壁增厚、上皮结构破坏、杯状细胞数量减少和嗜酸性粒细胞浸润增加（图3）。对照组和载体组的斑马鱼没有表现出任何炎症迹象。

有趣的是，在去除肠道期间安乐死后，我们观察到对照组和载体组的胆囊呈亮绿色，而在注射40 mM和80 mM TNBS的斑马鱼中变为深绿色，在注射了160 mM和320 mM TNBS的斑马鱼中变为褐色。

2、时间响应

为了评估炎症的急性期，重复了相同的实验。用溶解在25%乙醇中的320 mM TNBS剂量直肠注射鱼，并在诱导后3、6和14 hpi、1、3和7天（dpi）处死。组织学评分显示对TNBS的反应非常快（图 4）。在3 hpi时，观察到严重的炎症迹象（分数= 6）。在6 hpi时达到炎症峰值（分数= 8）。在14 hpi时，炎症评分下降（评分= 6）。在1 dpi时，仅观察到中度炎症（分数= 4），而在3 dpi时，炎症分数降至基线，并在7 dpi时完全恢复。

3、神经元亚群

TNBS诱导的结肠炎对三种肠道神经元群的影响在炎症高峰时进行评估（剂量为320 mM处理6 hpi）。在发炎和非发炎的肠道中，神经元密度从肠道的口腔到反面增加，但在比较两种肠道组织时，没有观察到神经元密度的显着变化（图6A）。

氮能神经元的比例分布在炎症和非炎症条件之间没有显示任何变化（图5 A，B和6B）（对照：PI 23.6±1.2%；MI 23.3±2.7%；DI 22.3±1.6%；总体 23.07±1.8%//TNBS：PI 24.1±2.1%；MI 22.91±2.1%；DI 24.05±2.8%；总体 23.7±1.9%），而胆碱能和5-羟色胺能的比例显示变化。对照和TNBS处理的鱼中5-羟色胺能神经元的比例沿着肠道长度减少（图5 C，D和6C）。

相比之下，TNBS处理的鱼显示每个肠道部分的5-羟色胺能神经元比例增加（对照：PI 23.6±2.5%；MI 18.4±3.0%；DI 11.5±1.9%；总体 17.8±3.1%//TNBS：PI 28.6±2.6%；MI 23.2±1.4%；DI 18.4±1.6%；总体 23.4±1.3%）。在对照样本中，胆碱能神经元的总体比例为39.3±3.1%，不同肠道区域之间没有任何差异。然而，经TNBS处理的动物在DI中显示出胆碱能神经元比例降低（对照：38.48±4.6%//TNBS：21.95±2.5%）（图5 E，F和6D）。

五、讨论

基于有关斑马鱼化学诱导小肠结肠炎的实验和建议，我们在确定了TNBS的很好的剂量(320 mM)和时间(6小时)以诱导炎症的急性期后，优化了斑马鱼TNBS诱导的小肠结肠炎模型。在炎症的急性期，该模型用于检查小肠结肠炎对ENS的影响。没有观察到对GI壁不同部位的神经元密度或氮能肠神经元群的比例分布的影响。然而，小肠结肠炎导致整个肠道中5-羟色胺能神经元比例增加，以及肠道远端胆碱能神经元比例下降。

评分系统用于评估炎症程度，如先前在哺乳动物和斑马鱼模型中描述的胃肠道炎症。我们对小肠结肠炎急性期杯状细胞数量减少的观察结果与研究表明，在斑马鱼的遗传和化学小肠结肠炎模型中杯状细胞数量减少甚至耗尽，但与之前的TNBS结果不一致研究显示没有变化，或杯状细胞数量增加。在哺乳动物中，杯状细胞耗竭的数据也不是明确的，有报道称杯状细胞数量不变或减少。与之前对成年斑马鱼的研究一致，我们在小肠结肠炎的急性期观察到肠壁增厚、上皮破坏和嗜酸性粒细胞浸润。这些现象也在TNBS诱导的结肠炎急性期的啮齿动物模型中得到证实。人体IBD研究同样报告了肠壁增厚和上皮结构破坏。在人类中，嗜酸性粒细胞的数量及其原位激活在IBD的急性期而非慢性期增加，表明这些粒细胞在观察到的病理症状中起关键作用。

总之，本研究描述了一种化学诱导成年斑马鱼DI结肠炎的方法。在急性期，炎症伴随着神经元含量的不平衡，与在IBD患者和实验哺乳动物模型中观察到的神经元变化相当。除了其多功能特性和可用的遗传工具外，这种斑马鱼模型成为揭示IBD病理学机制和测试新IBD疗法的极好资源。

文丨Leen Uyttebroek,Casper Pype, Guy Hubens, Jean-Pierre Timmermans, Luc van Nassauw

翻译丨彭逸

DOI丨European Journal of Histochemistry 2020; 64:3161