IF=14.8丨毒理学评价模式生物斑马鱼在食品科学领域中的应用

编者按

食品安全一直是人们关注的领域。选择稳定、高效的模式生物对食品毒理学研究尤为重要。斑马鱼是小型脊椎模式动物，与哺乳动物模型相比具有生命周期短、繁殖能力强、饲养方便、成本低等特点，其基因与人类有70%的同源性。斑马鱼胚胎透明易观察，且具有对环境敏感的优点，因此被用作生物传感器。斑马鱼及其胚胎已被广泛应用于食品毒理学评估。

今天，我们分享2023年7月由湖北师范大学刘细霞副教授团队、中国农大许文涛教授合作发表在国际食品顶刊《Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety》（JCR Q1，中科院一区TOP期刊，IF 14.8）的一项研究成果——Zebrafish as model organisms for toxicological ev

aluations in the field of food science，该研究系统而全面地总结了以斑马鱼为模式生物的食品毒理学研究，主要内容包括：食品毒理学评价的多维机制和构效关系研究；根据食品中的八种危害物类型对相关研究进行了分类，包括真菌毒素、农药、抗生素、重金属、内分泌干扰物、食品添加剂、纳米颗粒和其它与食品有关的成分；对斑马鱼在食品毒理学研究中的应用进行了展望，以期为食品科学领域的研究人员提供有价值的参考。

文章题目

Zebrafish as model organisms for toxicological evaluations in the field of food science

杂志：Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety（JCR Q1，中科院一区TOP期刊，IF=14.8）

发表时间：2023年7月

作者：刘细霞，许文涛，侯莹钰等

单位：湖北师范大学食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室；中国农业大学

项目资助：由湖北省教育厅科学研究计划重点项目（D20222503）、食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室开放基金（EWPL202103）、湖北师范大学国际化项目库（HBNUIP-20220302L）、湖北省教育厅科学研究计划项目（Q20212503）、湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队计划（T2022028）等项目资助。

01、研究结论

1.  许多研究已经描述了食品中的大多数化学危害物单一物质的毒性作用，包括氧化应激的诱导、发育毒性、行为毒性或器官毒性等。由于人们在日常生活中经常接触到有毒物质的混合物。因此，出现了越来越多的关于类似或不同类型的化学物质的联合毒性作用研究，并开发出了相应的解毒剂。然而，需要更多的研究来关注遗传毒性、神经毒性和生殖毒性及其机制。影响和改善单一毒性和联合毒性的因素仍有待进一步探讨。

2. 在大多数研究中，有毒物质是直接添加到水中的，而且斑马鱼在不同发育阶段的暴露模式存在差异，这使得研究个体的毒物动力学过程和表型变化的剂量限制变得复杂。此外，斑马鱼对助溶剂浓度和溶液pH值的耐受性有限。对水溶性较差和毒性作用更强的有毒物质进行毒理学研究，需要严格选择适当的发育阶段和暴露方法，以获得稳定和有意义的结果。

3. 斑马鱼胚胎将在食品毒理学评价领域发挥更重要的作用，特别是基于其高通量应用特性的生物标志物筛选，并且可与代谢组学和转录组学等其他跨学科研究相结合。

02、研究背景

斑马鱼（Danio rerio）作为一种脊椎动物，被广泛应用于生命科学领域。其拥有与人类相似的组织器官和系统，基因和信号通路与人类高度保守，且神经发生、轴突发生、神经元亚型特异性方面等与哺乳动物高度相似。与用于毒理学评价的啮齿类动物相比，斑马鱼具有生命周期短、繁殖力强、饲养成本低的特点。由于其体型小且繁殖率高，利用斑马鱼可以筛选更多样本，也更有可能检测到具有生物学意义的反应。

自21世纪以来，斑马鱼在生态学、医学、环境毒理学等领域得到了广泛应用（Asharani等人，2011；Jin等人，2018；Li等人，2018；Wang等人，2015）。国际标准化组织（ISO）、经济合作与发展组织（OECD）、国家标准化管理委员会已颁布20多项斑马鱼用于化学品及环境毒性评价的标准文件，如ISO-15088-2008、OECD 236-2013、《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》(GB/T 13267—1991)等，为以斑马鱼作为毒理学评价模式生物奠定了基础。

食品安全与民生息息相关。在以往的研究中，传统的毒理学评价是以小鼠（Mus musculus）为研究对象开展的，但小鼠在食品安全研究中存在诸多不足，如实验周期长、成本高等。近年来，斑马鱼在毒性评价中的应用日益广泛，被用于评估食品中化学物质的危害及潜在风险，并阐明新的毒性机制等（Gaur等人，2018；Kim等人，2011；Komoike等人，2020）。

此外，斑马鱼胚胎对环境更敏感，能在体外受精后迅速生长，这些特性有助于进行斑马鱼行为分析，并用于发育毒性与致畸性研究等。目前，斑马鱼胚胎已被用作生物传感器，以快速筛选评价大批量化学物质的生物活性及其毒性（Noyes等人，2015）。然而，在评价不同物质的毒性时，斑马鱼与哺乳动物之间的差异不容忽视（Bambino & Chu，2017）。因此，需要进一步研究以确定斑马鱼是否适用于食品毒理学评估（Focker等人，2022）。

本文综述了以斑马鱼为模式生物的食品毒理学研究，包括真菌毒素、农药、抗生素、重金属、内分泌干扰物、食品添加剂、纳米颗粒和其它与食品有关的成分；以及食品毒理学评价的多维机制和构效关系研究等，并对斑马鱼在食品毒理学研究中的应用进行了展望，以期为食品科学领域的研究人员提供有价值的参考。

03、斑马鱼在毒理学评价中的应用

1.  利用斑马鱼建立多维度毒性评价机制

通过斑马鱼表型、生物标志物、代谢途径、生理及遗传毒性效应等多维度评价机制，可以对食品中存在的化学危害进行毒理学评价。

就胚胎表型而言，斑马鱼透明、可观察，其早期胚胎透明，又是在体外生长发育，可以通过显微镜很好地观察胚胎各个时期的发育状况。根据斑马鱼在暴露一段时间后表型的变化，如发育异常(体长改变、卵黄囊吸收延迟)、畸形(脊柱弯曲、心包水肿、肝组织形态受损)和行为异常等，可以对化学品的毒性进行评价。

近年来，利用斑马鱼开展毒性评价的研究逐年增加，自2019年以来已发表超过5000篇，其中约8%与食品成分/化学品相关，涉及氧化应激、炎症反应、肝毒性、肾毒性、心脏毒性、神经毒性、生殖毒性及遗传毒性等相关研究，并进一步阐明了其作用机制（见表1）。

表1 利用斑马鱼阐明毒性效应及其相关机制

利用斑马鱼开展多维度毒性评价已被应用于食品安全领域，不仅提高了研究效率，降低了研究成本，还避免了动物福利问题等（Cassar等，2020）。

2. 以斑马鱼为模型生物的毒理学评价结构-活性关系研究

通过斑马鱼模型来研究化学物质的结构与其毒性效应之间的关系，可以为阐明不同浓度物质的毒性效应差异、毒性机制探索和风险评估提供依据。已有研究表明，在化学物质中，如头孢菌素、1,2,4-三唑、无机纳米材料、双酚类化合物等，斑马鱼的结构-活性关系研究表现出色。基于斑马鱼胚胎构建的食品剂量-反应和构效关系模型，对开展食品毒性评价具有重要意义。

04、斑马鱼在食品毒理学评价中的研究进展

1.  霉菌毒素

霉菌毒素是谷物或饲料中霉菌生长产生的有毒代谢产物，目前，人们已发现了数百种霉菌毒素，这些毒素在动物体内有不同的毒性、代谢途径和靶器官，是最危险的食品污染物之一。为了建立食品残留限量标准，研究每种霉菌毒素的毒理学机制至关重要。

以往的研究结果显示，霉菌毒素在斑马鱼中会引起不同类型的毒理学效应，如行为异常、致畸性、发育毒性和肝毒性等。在表2和图1中，研究人员总结了霉菌毒素对斑马鱼及其胚胎的毒理学效应。大多数结果集中在霉菌毒素中单一毒素毒性的研究上。

表2 霉菌毒素对斑马鱼的毒性效应

图1  黄曲霉素对斑马鱼的毒性效应

研究表明，暴露于黄曲霉素B1(AFB1)的斑马鱼胚胎，其代谢特征与哺乳动物显示的肝毒性一致，且在与人类不良后果相关的浓度下观察到了致畸作用。

此外，Wu等人(2019)发现，在6 hpf-15dpf期间，将斑马鱼胚胎暴露于浓度为15-75ng/mL的AFB1时，斑马鱼表现出神经发育异常，且神经毒性标志物(如gfap和huC)水平发生改变；将斑马鱼暴露于AFB1或赭曲霉毒素A时，会抑制与人类糖尿病相关的两个关键转录因子hhex和prox1的表达，且治疗组表现出肝毒性。

除单一毒素效应外，研究还报道了两种或三种毒素共同暴露的毒性效应，Juan-Garcia等人(2021)研究了真菌毒素棒曲霉素、棒曲霉素A和棒曲霉素B在二元或三元混合物中的联合毒性

除了单一毒素效应外，研究还报告了两种或三种毒素的共同暴露毒性效应（Juan-Garcia 等人，2021；Wang, Wang 等人，2021），所有混合组均表现出发育毒性和行为的改变。

在回顾相关文献后，我们发现，通过斑马鱼及其胚胎对真菌毒素开展毒理学研究，可以从行为、组织形态深入到分子水平的毒性机制研究，从单一毒素的毒性评估扩展到多种毒素的毒理学研究，但还需要对多种毒性机制进行更多研究，如生殖毒性、心脏毒性等。不同霉菌毒素混合物与其他有毒物质的联合毒性研究已成为一种趋势。

2. 农药

当前，全球农药市场规模巨大，一些果蔬中农药残留超标或超范围存在屡禁不绝。越来越多的研究利用斑马鱼来探究农药对斑马鱼生长、发育及其生理活动的影响。

二噁英（dioxins，PCDD/Fs）及二噁英类污染物（DLCs）作为含氯农药的副产物，是迄今为止化合物中毒性最大且含有多种毒性的物质之一，通过食物摄入会对人类健康产生不利的影响。已有研究表明，斑马鱼胚胎不仅可以被用于研究农药的毒性，而且在解毒剂的开发中也发挥了重要作用。图2和表3中总结了斑马鱼在农药毒性评价中的应用。

图2 斑马鱼在农药毒性分类研究中的应用

表3 部分农药对斑马鱼的毒性效应

由于农药种类繁多，在日常生活中人们经常同时接触到两种或多种农药的混合物。利用斑马鱼模型进行急性毒性实验发现，不同组合或不同比例的农药混合物具有不同的毒性作用；也有研究评价了农药混合物对斑马鱼主要器官、组织和生理活动的联合毒性作用，发现相比于单独暴露于一种农药中，农药混合物中的斑马鱼形态缺陷发生率更高，神经元也更大。

除了用于农药毒性分类、风险评估、联合毒性评价之外，利用斑马鱼模型也可以用于农药慢性毒性、农药在分子水平上的毒性机制研究、不同物质诱导的农药毒性研究及其机制研究等，对评估、管理和降低农药风险具有重要意义。

3. 抗生素

随着社会经济的发展和人口的增长，人们对食品安全和质量的要求不断提高，这引发了人们对食品中抗生素存在的担忧。β-内酰胺类抗生素（β-lactams）、喹诺酮类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素等被广泛应用于动物疾病防治和食品保鲜。然而，抗生素等药物残留，容易引发耐药性并最终影响人类健康，因此，成为了广大消费者关注的焦点问题。

欧盟规定了动物源性食品中不同抗生素的最大残留限量(NO.2377/90/EC)，但在水体、土壤，甚至很多动物的肠道中都曾检测到抗生素的残留，从而影响生活在受污染水体中的鱼类。以斑马鱼及其胚胎为模式生物，研究人员系统评估了抗生素的毒性，进一步明确了残留标准，并探讨了其毒性机制（图3）。

图3 斑马鱼对不同抗生素的毒性效应

Petersen等人（2021）探究了不同抗生素，即头孢他啶、环丙沙星和氯四环素对斑马鱼行为的影响；以斑马鱼及其胚胎为模式生物的实验表明，暴露于磺胺类药物、四环素类和其他水产养殖中常用的抗生素，会影响斑马鱼胚胎的孵化，产生致畸效应，并损害斑马鱼的肠道健康（Zhou等人，2018）；大环内酯类抗生素会对斑马鱼胚胎造成严重的心脏毒性和发育毒性（Yan等人，2019），并对斑马鱼造成肝毒性（Zhang等人，2020）。

与农药联合毒性研究相类似，斑马鱼也是研究抗生素联合毒性的良好模式生物。Zhang等人（2016）研究了氟喹诺酮类、四环素类药物对斑马鱼胚胎的联合毒性，发现联合毒性相当于或略低于单独使用四环素的毒性，这表明抗生素之间可能存在拮抗作用。

近年来，抗生素毒性研究开始采用跨学科方法或侧重于植物源抗生素。Han等人（2018）报告了利用斑马鱼模型结合转录组学、ADMET研究来系统评估头孢菌素的毒性；植物源性天然产物，如多酚类、生物碱类、单宁等，被看作抗生素的替代品或补充剂，以改善细菌的耐药性问题。然而，这些物质是否具有毒性需要进一步明确，但以往的研究尚集中在利用斑马鱼作为模式生物阐明植物源抗生素的抗菌活性研究。未来，斑马鱼将在研究植物源抗生素的剂量-反应关系及其潜在毒性方面发挥更广泛的作用。

4. 重金属

近年来，土壤和工业废弃物中的重金属污染物引发了许多食品安全问题。食品中可能含有多种重金属污染物，如铜、铬、镉、铅、汞等。重金属具有强累积毒性，且半衰期很长，通过食物链中生物富集和生物放大，对人体健康构成潜在威胁。因此，评估不同浓度和组合的重金属安全风险并阐明其潜在毒性机制，对人类健康至关重要。

研究表明，重金属对斑马鱼胚胎孵化率、寿命、心率及骨骼发育都有影响（Gouva et al., 2020），斑马鱼在重金属毒性评价中的应用总结见图4、表4中。

图4 斑马鱼在不同重金属毒理学研究中的应用

表4 一些重金属对斑马鱼的毒性效应

作为人体必需的微量元素，铜和铬的摄入不足或过量都会影响健康。在浓度为9微克/升、暴露96小时的情况下，铜对斑马鱼的记忆和行为产生了不利影响（Acosta et al., 2016）；曹等（2019）将斑马鱼暴露于10微克/升的硫酸铜中30天后，发现斑马鱼性腺发育发生改变，类固醇激素水平紊乱，内分泌相关基因表达异常，这些均抑制了斑马鱼的生长与繁殖；铬对斑马鱼胚胎具有致畸性，喂食被铬污染的饲料时，斑马鱼形态异常、且存活率下降（Tye et al., 2018）；

镉对斑马鱼的毒性作用包括免疫毒性、神经毒性、肝毒性及发育毒性、行为毒性等；暴露于重金属铅会导致斑马鱼肠道菌群失衡、肝脏代谢紊乱、发育毒性和神经毒性等。陈等（2012）证实，斑马鱼胚胎暴露于铅会导致畸形，并以剂量依赖的方式改变斑马鱼幼鱼的自发运动和行为，导致记忆缺陷；刘等（2016）发现，亲代雌性斑马鱼暴露于甲基汞（MeHg）会导致后代形态变化和神经行为功能障碍。

与农药、抗生素研究类似，研究人员也使用斑马鱼这一模型生物来研究重金属混合物的毒性作用（Liao et al., 2021）。高等（2018）探讨了镉、铅和铜的联合毒性，发现铜-镉、铜-铅对斑马鱼的联合毒性具有协同作用。

斑马鱼还被用于探究重金属与农药、抗生素及其他非金属化合物的联合毒性；解毒物质的研发及其作用机制的研究等，预防和控制食品中的重金属污染并对其进行标准化尤为重要。未来，斑马鱼将进一步在多种重金属和非金属物质的联合毒性机制研究及解毒物质的开发中发挥关键作用。

5.  内分泌干扰物

内分泌干扰物（EDCs），又称环境激素，是影响人体、动物体内正常激素水平，破坏内分泌系统的一类外源性化学物质。杀虫剂、塑料及药物等的一系列产品中均含有EDCs，它们残留在食物及日常生活环境中，往往通过食物链对人体产生不利影响，并进一步影响生态平衡。

通过观察斑马鱼及其胚胎暴露于普通食品中残留EDCs的生理指标和结构变化，可以进一步研究EDCs对人类生理过程的影响。以斑马鱼为模型生物，对食品中常见EDCs的毒性研究总结见表5。

表5 斑马鱼对某些内分泌干扰物的毒性效应研究

长期暴露于BPA及其类似物中的斑马鱼，可能引起行为障碍、肾脏疾病、生殖毒性等。表5简要概述了常见EDCs及其混合物引起的神经行为障碍、代谢紊乱、甲状腺功能异常等毒性作用。基于EDCs的毒性评估，斑马鱼及其胚胎经常被用作评价化合物内分泌干扰作用的模型生物，后续将进一步探究其相关机制和方法。

6.  食品添加剂

食品添加剂是化学合成或天然物质，如色素、防腐剂和甜味剂，它们被添加到食品中，用以改善食品的质量、颜色、香味和口感等，从而满足食品保鲜、加工的需求。尽管许多食品添加剂的安全性已得到证实，但近年来由食品添加剂引起的食品安全问题逐渐显现，引起了越来越多研究人员的关注。因此，利用斑马鱼这一模型生物来研究食品添加剂毒性作用的研究数量有所增加。

食品添加剂对斑马鱼的毒性作用主要表现为发育毒性、心脏毒性、生殖毒性等。用斑马鱼胚胎评估柠檬黄、日落黄、苋菜红和诱惑红等4种偶氮染料的发育毒性发现，当浓度为5mM（低于ADI，7.5 mg/kg体重）时，未出现明显的畸形，而当浓度高于ADI时，斑马鱼胚胎出现了孵化困难、发育异常等。除此之外，焦糖色素E150d以剂量依赖的方式对斑马鱼胚胎的孵化、存活、表型及心跳产生毒性作用，并导致骨骼肌、心包破损伤等（Capriello et al., 2021）；还有研究发现，食品添加剂京尼平对斑马鱼胚胎具有发育毒性，会导致心包水肿，并可能在斑马鱼中引起心脏毒性、肝毒性、肾毒性等（Xia et al., 2021）；

人工甜味剂，如阿斯巴甜（APM），在高脂饮食中可进一步诱发毒性；Kim等人（2011）发现，在高脂血症存在的情况下，APM对斑马鱼存活率的负面影响比糖精（SAC）更大，并会导致运动能力下降、脑炎症增加；Han等人（2021）和Li等人（2021）对斑马鱼的全面神经行为特征进行了表型分析，并系统地描述了SAC和APM的潜在行为和神经毒性作用，如图6所示。

图6 人工甜味剂对斑马鱼神经行为表型的影响

食品中防腐剂的毒性也引起了食品安全的关注。Pradhan等人（2020）发现，乙氧喹改变了参与应激反应、细胞周期和DNA损伤途径的基因表达水平，从而导致斑马鱼发育性神经毒性和运动缺陷；Huang等人（2021）发现，斑马鱼暴露于50 mg/L的脱氢乙酸钠，可导致心脑血管损伤，且通过在斑马鱼中诱导Ca2+和维生素D3缺乏，可进一步导致心肌细胞中Ca2+依赖的线粒体损伤。食品添加剂的毒性作用和研究结果见表6。

表6 一些食品添加剂对斑马鱼的毒性效应

因此，需要基于斑马鱼进一步研究食品添加剂的毒性，后续可以更多地关注食品添加剂在分子水平上的毒性机制及其混合物对肾、肝、心血管、神经系统的影响。

7. 纳米颗粒

随着纳米技术的发展，纳米颗粒由于其独一无二的特性，如增强食品风味、颜色、稳定性及抗菌活性等，被用作食品抗菌包装膜、食品添加剂，在食品领域日益流行。通过饮食摄入纳米颗粒，对人类健康的潜在威胁已引起研究人员的关注。

本文回顾了过去十年中单一纳米颗粒毒性作用及与其他物质联合毒性作用的研究。有研究发现，斑马鱼暴露于一定剂量的金属或非金属纳米颗粒会导致脑毒性、内源微生物群紊乱、生殖毒性、致畸形等（表7）。

表7 某些纳米塑料对斑马鱼的毒性效应

此外，以斑马鱼为模型生物，研究人员还探究了毒性诱导机制及解毒物质；纳米颗粒的毒性还可能与其形态有关，且可能与其他有毒物质，如重金属相互作用。因此，应开展更多实验，对斑马鱼纳米颗粒毒性作进一步研究。

8. 其他与食品相关的成分研究

除上述各种污染物外，食品中还存在着许多内源性物质，如黄酮类化合物、咖啡因和乙醇，其对人类健康的影响尚不清楚，值得深入研究。这些物质通过饮食自然摄入，具有高度的暴露潜力和生物活性，可以使用斑马鱼进行相关毒性研究。

黄酮类化合物是广泛存在于谷物、果蔬中的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理作用，但研究表明，其可能导致生殖毒性（Jefferson等人，2005）。

除黄酮类化合物外，当斑马鱼胚胎在受精后15-48小时暴露于100和150 mg/L的咖啡因时，其体节间血管缩短变细，血管标记基因的表达也发生了变化（Basnet等人，2021）。其他与食品相关的成分也已通过斑马鱼进行相关研究，以确保食品安全。

05、编者点评

综上所述，本研究阐述了以斑马鱼为模式生物的食品毒理学研究，包括真菌毒素、农药、抗生素、重金属、内分泌干扰物、食品添加剂、纳米颗粒和其它与食品有关的成分；食品毒理学评价的多维机制和构效关系研究等，并对斑马鱼在食品毒理学研究中的应用进行了展望。

相信斑马鱼模型将在食品毒理学评估中发挥更大作用，特别是在高通量生物标记物筛选和跨学科研究中。通过斑马鱼模型的研究，我们能够更快速、更经济地评估食品中的潜在危害，为食品安全监管提供科学依据，保护公众健康。让我们共同关注食品安全，支持使用斑马鱼等创新模型生物进行科学研究，为打造健康饮食环境贡献力量！

作为健康美丽产业CRO服务开拓者与引领者、斑马鱼生物技术的全球领导者，环特生物搭建了“斑马鱼、类器官、哺乳动物、人体”多维生物技术服务体系，开展健康美丽CRO服务、科研服务、智慧实验室搭建三大业务。目前，环特已建立200多种斑马鱼模型，胃癌、脑类器官、心脏类器官及各种肿瘤类器官培养平台，欢迎有需要的读者垂询！