研究成果丨利用斑马鱼筛选具有抗血管生成作用的天然产物及其作用机制

编者按

血管生成作为从现有血管生成新血管的生理过程，在胚胎发育和伤口愈合中发挥着至关重要的作用。然而，异常加速的血管生成或病理性血管生成与多种疾病，包括癌症有关。由于血管生成在肿瘤的增殖和转移中起着关键作用，因此抗血管生成策略被认为是一种有前途的新癌症治疗方法。

今天，我们分享上海交通大学医学院附属第九人民医院研究团队发表在《Drug Design, Development and Therapy》的一项研究成果——In vivo Screening of Natural Products Against Angiogenesis and Mechanisms of Anti-Angiogenic Activity of Deoxysappanone B 7,4'-Dimethyl Ether，该研究利用斑马鱼筛选了具有抗血管生成潜力的天然产物，并初步探讨其抗血管生成机制。

该研究使用了MicroSource的天然产物库中的240种化合物，并利用转基因斑马鱼血管荧光品系进行筛选。斑马鱼胚胎在受精后24小时暴露于这些天然化合物中，继续培养24小时后，通过荧光显微镜观察并量化间节血管(ISVs)的形态变化。同时，使用定量实时PCR检测斑马鱼胚胎中与血管生成相关基因的表达谱。研究结果表明，从240种化合物中筛选出5种具有潜在抗血管生成活性的化合物，其中deoxysappanone B 7,4'-dimethyl ether(Deox B 7,4)在剂量依赖性地抑制ISVs形成方面表现出抗血管生成活性。

文章题目

In vivo Screening of Natural Products Against Angiogenesis and Mechanisms of Anti-Angiogenic Activity of Deoxysappanone B 7,4'-Dimethyl Ether

杂志：Drug Design, Development and Therapy（IF=4.7）

发表时间：2020年3月5日

作者：Chen K, Fan Y, Gu J, et al．

单位：上海交通大学医学院附属第九人民医院

01、研究成果

1.  天然产物库中240个化合物的初步筛选综述

本研究对240种天然产物化合物的初步筛选结果进行了总结。这些化合物取自MicroSource Discovery Systems的天然产物库，并在斑马鱼胚胎模型中进行了血管生成抑制和毒性评估。

筛选结果显示，有5种化合物（dihydromunduletone、Deox B 7,4、ononetin、mundoserone和pomiferin）表现出强烈的抗血管生成活性。此外，表中还列出了12种对斑马鱼胚胎具有毒性的化合物，它们引起的毒性效应包括100%死亡率、器官特异性毒性（皮肤、肌肉、心脏和鳍）以及抑制色素沉着和孵化。这些数据强调了在药物发现过程中，除了活性外，还需要考虑化合物的安全性和毒性。

表1

2. 对血管生成的影响

研究人员展示了24小时受精后（hpf）的斑马鱼胚胎，在经过24小时处理后，分别用0.1%二甲基亚砜（作为对照组）、10 μM的几种领先化合物，或5 μM的阳性对照药物PTK787处理的效果。图中的亮场（明场）和荧光图像显示了对照组和处理组中血管的形态，尤其是节间血管（ISVs）的形成。

在对照组中，可以观察到完整的ISVs、背主动脉（DA）和背侧长轴吻合血管（DLAV）。相比之下，经PTK787处理的胚胎显示出这些血管形成完全被抑制。而经Deox B 7,4、ononetin或pomiferin处理的胚胎则显示出不完整的ISVs，偶尔可以观察到DA的初发芽。

这些结果表明，这些化合物具有潜在的抗血管生成活性，能够影响斑马鱼胚胎的血管发育。

图1 斑马鱼胚胎在暴露于不同化合物后的血管形态，注：DLAV:背侧纵向吻合血管；ISV:节段间血管；DA:主动脉背侧；PCV:后主静脉。

3. 三种化合物的化学结构

Deox B 7,4（脱氧萨帕酮B 7,4'-二甲醚）、ononetin（刺芒柄花素）和pomiferin（番石榴素）。这些化合物在斑马鱼胚胎模型中表现出了显著的抗血管生成活性。

具体来说，Deox B 7,4的结构特征是含有一个脱氧萨帕酮核心，带有7,4'-二甲醚取代基；ononetin和pomiferin则分别展示了它们独特的化学结构，这些结构细节对于理解这些化合物如何与生物靶标相互作用以及它们如何影响血管生成过程至关重要。通过这些化学结构的可视化，研究人员可以进一步探究这些化合物的药理活性和潜在的抗血管生成机制。

图2  三种从天然产物库中筛选出来的化合物的化学结构

4. 斑马鱼胚胎在接受不同浓度Deox B 7,4处理后的血管形态变化

图像显示了24小时受精后（hpf）的斑马鱼胚胎，在经过24小时处理后，分别用0.1%二甲基亚砜（作为对照组）、1 μM、2.5 μM和5 μM的Deox B 7,4，以及5 μM的阳性对照药物PTK787处理的效果。

结果显示，随着Deox B 7,4浓度的增加，斑马鱼胚胎中形成的完整节间血管（ISVs）数量显著减少，表明Deox B 7,4以剂量依赖性方式抑制了ISVs的形成。特别是在5 μM浓度下，Deox B 7,4几乎完全抑制了ISVs的形成，显示出高达99.64%的抑制率。

此外，图中还提供了定量分析结果，进一步证实了Deox B 7,4的抗血管生成效果。这些发现支持了Deox B 7,4作为潜在抗血管生成剂的治疗效果。

图3 斑马鱼胚胎在接受不同浓度Deox B 7,4处理后的血管形态变化

5.  Deox B 7,4对斑马鱼胚胎中与血管生成相关基因表达的影响

Deox B 7,4显著下调了包括dll4、hey2、efnb2、slit2、slit3、robo1、robo2、robo4、fgfr3、COX2、ptp-rb和pik3r2在内的多个基因的表达，而上调了fgfr1、vegfr-2和mmp9的表达。这些基因在血管生成过程中扮演着关键角色，例如dll4/Notch信号通路在动脉-静脉分化和血管生成尖端细胞选择中发挥作用，slit/robo信号通路在血管稳定性和血管渗透性中发挥作用，COX-2和mmp9在炎症性血管生成中发挥作用。

Deox B 7,4对这些基因表达的调节表明，它可能通过影响这些信号通路来抑制血管生成，进一步支持了其作为抗血管生成剂的潜力。

图4 Deox B 7,4对斑马鱼胚胎与血管生成相关基因表达的影响

6. Deox B 7,4抑制血管生成的潜在分子机制

Deox B 7,4可能通过影响多个与血管生成相关的信号通路来发挥作用。具体来说，Deox B 7,4可能抑制slit2/robo1/2和slit3/robo4信号通路，这些通路涉及血管稳定性和血管渗透性；同时，它也可能抑制cox2/ptp-rb/pik3r2通路，这些通路与炎症性血管生成相关。

此外，模型还指出Deox B 7,4可能激活vegfr-2/fgfr1/mmp9通路，这可能与其抗血管生成活性有关。这些信号通路的调节可能导致血管生成过程中关键基因表达的变化，从而抑制血管形成和生长。图5为理解Deox B 7,4如何作为一种抗血管生成剂提供了直观的分子机制解释，并为进一步的研究提供了方向。

图5 Deox B 7,4抑制血管生成的潜在分子机制

02、编者点评

综上所述，本研究从MicroSource Discovery Systems的天然产物库的240种化合物中，鉴定出5种具有抗血管生成活性的化合物。其中，Deox B 7,4 以剂量依赖的方式抑制斑马鱼胚胎中ISVs的形成。

血管生成相关基因的表达谱表明，Deox B抑制slit 2/robo 1/2、slit 3/robo 4、cox 2/ptp-rb/pik 3r2、dll 4/hey 2/efnb 2a 信号通路以及vegfr-2/fgfr1/mmp 9 的表达，从而发挥抗血管生成作用。为了揭示 Deox B 7，4 在血管发育过程中如何介导上述信号通路，未来需要进行进一步的研究。

作为健康美丽产业CRO服务开拓者与引领者、斑马鱼生物技术的全球领导者，环特生物搭建了“斑马鱼、类器官、哺乳动物、人体”多维生物技术服务体系，开展健康美丽CRO服务、科研服务、智慧实验室搭建三大业务。目前，环特已建立200多种斑马鱼模型，胃癌、脑类器官、心脏类器官及各种肿瘤类器官培养平台，欢迎有需要的读者垂询！