合成肽作为目前成本最低抗原肽模拟技术已经在免疫制备抗体行业广泛被接受，大量被用于模拟制造识别大生物分子的抗体的基本原料,特别是在制备甲基化抗体,磷酸化抗体和糖基化抗体方面,这项技术具有不可比拟的优势. 由于它操作技术简单,原材料成本低廉,生产周期较短以及人工场地要求简单的特点,被不少生物界同仁认为是未来五年海外生产向中国制造转移又一潜力产业.在过去的几年中，国内已经涌现出数十家进行大规模定制抗体的生产企业,主要集中在江浙沪一带. 合成的多肽抗原由于分子较小,免疫到动物体内后很难产生免疫应急反应,因此在免疫前通常要偶联一个载体蛋白.常用的载体蛋白有血蓝蛋白(KLH),牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA).根据载体蛋白侧链氨基与多肽抗原上偶联位置的不同,我们定义为以下三种:N端氨基偶联,C端羧基偶联和Cys巯基偶联. 偶连的方式与偶连的活化剂和氨基酸组成有关。 通常有下列三种方法供选择： 1．EDC:通过C端羧基连接，一般要求序列中无Glu(E)，Asp (D)或一个酰胺化的C端 2．戊二醛通过N端的氨基偶连，要求序列中无Lys (K)或N端没有被乙酰化 3．MBS:通过Cys的巯基基团与载体上的氨基连接.如果序列中无Cys，可添加Cys或Mpa，最好增加在N端。 明皓生物提供以下藕连服务，分别用下列符号代表它们之间的组合： MB01 BSA-Peptide N terminus MB02C BSA-Peptide C terminus MB02Cys BSA-Peptide Cys MK01 KLH-Peptide N terminus MK02C KLH-Peptide C terminus MK02Cys KLH-Peptide Cys MO11 OVA-Peptide N terminus MO12C OVA-Peptide C terminus MO13Cys OVA-Peptide Cys 偶联好的载体复合物经过透析,再加入佐剂和进行乳化,就可以进行免疫了.经过一免,二免和增强免疫后,6-8周左右可以看到一个具有一般效价的制备多抗.这时候再通过取血,离心取上清的方法得到抗性血清.有条件的单位还通常会用标准蛋白Protein A/G进行抗体纯化,为了运输和储存需要有时会进行冻干处理.也有根据客户的需要用免疫的抗原挂到亲和层析柱上对抗体进行纯化,得到专一性更高的多克隆抗体. 单抗的制备要稍微复杂一些,时间跨度会更长,一个项目结束下来要半年左右的时间. 欢迎来订购多肽 Q Q号： 2022382221 公司电话： 027-87687992 公司传真： 027-87687992 电子邮件： order@moonbiochem.com 公司网址： http://www.moonbiochem.com

1. 氨基化及乙酰化 如果合成多肽为蛋白质的内部序列，通过N端乙酰化或C端氨基化可以去除多肽电荷使其更趋向于蛋白质的自然结构，同时增强了多肽对外肽酶的抵抗力。 2. 生物素及FITC标记 FITC是荧光标记的活性前体。为了有效的标记N端，可在多肽的N端和荧光基团之间插入七原子的胺己苯酸酯间隔结构(NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-COOH)；在C端进行生物素标记时，常在其末端加上一个赖氨酸残基，生物素被连接到赖氨酸侧链，同时赖氨酸的的正电荷也被去除。 3. 多种二硫键修饰 在半胱氨酸残基间制作二硫键可以实现多肽环状化，但由于二硫键是随机形成的，因此对于含多个半胱氨酸残基的多肽来说，这是个挑战。金斯瑞可在半胱氨酸指定的位置构建二硫键，能实现一条多肽内导入三个二硫键修饰。 4. 多种磷酸化 多肽磷酸化可以帮助研究磷酸化对多肽和蛋白结构的影响以及蛋白激酶的作用机理，金斯瑞已经成功地为客户合成了大量的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等磷酸化多肽。对于含有多个羟基氨基酸的多肽，可以通过交叉检测或Fmoc检测来选择、确定多肽的磷酸化。 5. KLH, BSA,OVA 多肽抗原由于太小而不能产生显著的免疫反应，因此需要将多肽抗原偶联到BSA、OVA、KLH等较大的蛋白载体上。KLH由于在ELISA或Western blotting检测中没有抑制作用从而不影响检测结果。常用的偶联原理是顺丁烯二酰亚胺理论，即将多肽中的半胱氨酸残基与载体蛋白偶联。因此合成抗原多肽时，在其N端或C端添加一个半胱氨酸残基有利于多肽与载体蛋白的偶联。 注：KLH是一种很大的凝聚蛋白(MW = 4*105 to 1*107)，由于它特殊的大小及结构，它在水中的溶解度不高，常常需要采取一些方法解决，但这并不影响免疫原性，免疫时常使用混合溶解的方法。 6. 聚乙二醇修饰 聚乙二醇修饰是将非离子的、无毒的、生物体不排斥的及高亲水性的聚乙二醇聚合体，通过化学方法偶联到大分子上（蛋白质、多肽等等）。聚乙二醇修饰的大分子由于溶解性（主要指疏水性药物）及生物利用率的增高，寄主内最小免疫反应的抗原伪装，肾清除率降低循环时间延长，从而提高了治疗能力。 7. 同位素标记 为了进行核磁共振实验，我们将多肽标记稳定的非放射性的同位素。标记2H、15N、13C、或 15N 及 13C同时标记的多肽合成后便于检测。如果您需要标记修饰，请提供您的序列及标记需求。 8. 复合抗原肽修饰 多抗原肽（Multiple-Antigen peptide, MAP）是生产高效价的抗多肽抗体和多肽疫苗的一种有效方法。多重抗原肽以赖氨酸的a-或e-基团形成主链，以多拷贝的肽抗原作外表层的分枝状合成多肽。根据赖氨酸的数目，可以合成不同数目侧链的多抗原肽，这样不必将抗原偶联到载体蛋白质便能产生高滴度、高亲和力的抗体。 欢迎来订购多肽 Q Q号：2022382221 公司电话： 027-87687992 公司传真： 027-87687992 电子邮件： order@moonbiochem.com 公司网址： http://www.moonbiochem.com

检测抗多肽反应是否发生的最简单方法就是抗多肽ELISA。有两种技术可以将多肽链接到ELISA板上。第一种方法就是直接将多肽链接到盘上。但如果链接氨基酸恰好是抗原决定簇的一部分，则抗体无法和多肽进一步链接，这样产生假阴性结果的可能性增加。第二种方法则是先将多肽与载体蛋白耦合，然后将多肽－蛋白耦合体链接到ELISA盘上。这种链接方法会使抗体－多肽的结合成功率提高，因为多肽不是直接嵌入盘膜，因而会更加暴露给抗体。这种方法因而更可靠，可重复性更高。需要注意的是，用于该方法的载体蛋白必须不同于用于免疫耦合的载体蛋白。这样会避免血清中抗载体蛋白反应所导致的高背景反应。 当做血清检测时，另一点需要记住的是，由于免疫多肽与自然多肽结构上的差别，检测时的抗多肽反应与试剂的抗多肽反应可能是不同的。任何检测，尤其是测定滴定量以决定收获点时，必须包括针对天然状态下蛋白的检测。当然可以做针对天然状态下蛋白的ELISA；但由于血清在不同检测体系中表现会不一样，因此最好在血清被日常使用的体系中进行蛋白识别鉴定。如果血清将用于免疫沉淀反应，就应该进行针对该反应的检测。 产生具有优良性能的抗体。订购定制的连接多肽，这样您可以增加抗原的免疫原性。如果多肽小于6KD，我们特别推荐做连接。半抗原载体连接选择包括： • keyhole limpet hemocyanin (KLH) • bovine serum albumin (BSA) • thyroglobulin (THY) • ovalbumin(OVA) 此外，您可以选择多抗原多肽（MAP）连接,它提供一个有分支的赖氨酸核心可替代的多种构型的合成多肽。在决定使用MAP技术还是传统的载体蛋白做连接时，请注意下列指导： • 半光氨酸会形成非特异二硫键。如果您关注二硫键的构型，使用KLH • 如果这种多肽是一直被成功地用来生产抗体，效仿已经使用的方法。 • 由于多肽通过C末端连接，而MAP技术有利于N末端或内部的多肽，不推荐使用在严格C末端连接的多肽上。连接载体也可能会导致一些空间障碍。使用KLH做C末端连接。 • 由于在传统的C18 HPLC时，MAP多肽的性能更类似于大的蛋白，因而未提供纯化。 长度 合适的多肽长度有利于优质合成，大部分的多肽抗原要求长度范围在12－16个残基，而且相对容易合成。尽管9个残基或更短的多肽已经是有效的抗原，但是长于12到16氨基酸的多肽可能包含几个决定簇。超过20残基的多肽开始提出了更大的合成挑战。 疏水残基 当设计多肽时，请注意诸如Ala,Cys,Ile,Leu,Met,Phe和Val类残基，它们会增加出现多肽可溶性问题的概率。注意保持疏水残基低于50％ 欢迎来订购多肽 Q Q号：2022382221 公司电话： 027-87687992 公司传真： 027-87687992 电子邮件： order@moonbiochem.com 公司网址： http://www.moonbiochem.com

不同氨基酸会形成不同的二级结构；延展的结构是为了给氨基酸侧链留下再大的自由空间，因此，那些有大量巨大侧链的氨基酸容易形成β折叠结构。这些氨基酸有：Tyr， Trp（有时Phe， Met）仅仅因为非常大， Val， Thr因为分支的β 碳是巨大而且非常占空间的；Cys在β 碳上有一个大的硫原子；β 碳是侧链上的第一个原子，因此巨大的侧链使主链非常拥挤。如果巨大基团在第二个碳上，如Leucine，则很少引起这种问题。 判断易形成α螺旋氨基酸的主要依据是氨基酸侧链包裹保护在螺旋核心的主链的氢键不被周围的水分子干扰： 容易形成α螺旋的有Ala， Leu， Met， Phe， Glu， Gln， His， Lys， Arg 下面列举的氨基酸有可以打乱二级结构形成的侧链，被叫做二级结构阻断者（Breaker）， 包括Gly， Pro， Asn， Asp， Ser： 在Gly中，侧链只是一个单一的氢原子，太小不能保护主链的氢键被周围的水分子影响。 Pro比较特殊因为它的侧链直接连于主链的N上，占据了形成氢键的位点。 在Asp， Asn， Ser中侧链在与附近主链N-H或C=O基团形成氢键的理想范围之内。因此实际上这些氨基酸并不是保护附近的氢键而是干扰它们。 一群Breaker会使该区域形成转角或环，因为干扰了周围氨基酸的正常二级结构而且形成二级结构环。 现在有很多的资料和计算机软件可以提供氨基酸的分子量和形成各种结构的可能性，有些软件还可以根据给出的序列预测其二级结构。氨基酸之间形成的二级结构是相互作用影响的。比如只有几个易形成α螺旋的氨基酸分散在易形成β折叠的序列中，最后呈现出来的是β折叠结构. 在一条多肽中，如果连续6个或更多氨基酸的段中有60%的为易形成α螺旋的同时少于20%的Breaker，则很容易形成α螺旋；如果在5个以上氨基酸的段中有60%的容易形成β折叠而少于20% Breaker，则容易形成β折叠；2个或2个以上的breaker出现在4个氨基酸的段中则会导致转角或环 欢迎来订购多肽 Q Q号： 2022382221 公司电话： 027-87687992 公司传真： 027-87687992 电子邮件： order@moonbiochem.com 公司网址： http://www.moonbiochem.com

组蛋白甲基化是表观遗传修饰方式中的一种，参与了异染色质的形成、基因印记、染色体失活和基因转录调控等，具有重要作用．甲基化研究是最近几年的涌现出来的一个新课题；在表观遗传学上，Arg和Lys上的甲基化会使组织蛋白可以在表观遗传上压抑或活跃化基因表现;其他氨基酸上的甲基化修饰会使肽的生物活性或稳定性产生变化，武汉明皓生物提供多种甲基化修饰，以满足您药物设计及研发的需要： Item:HM Methyl amino acids/甲基化肽 MH 1 {Arg(Me)}　　　精氨酸单甲基化 MH 2 {ADMA},{Arg(Me)2} asymmetrical　 精氨酸对称双甲基化 MH 3 {SDMA},{Arg(Me)2} symmetrical　　精氨酸不对称双甲基化 MH 4 {Tyr(Me)}　　 酪氨酸甲基化 MH 5 {Thr(Me)}　　 苏氨酸甲基化 MH 6 {Ser(Me)}　　 丝氨酸甲基化 MH 7 {Cys(Me)}, SMC　S-半胱氨酸甲基化 MH 8 {Lys(Me)}　　　 赖氨酸单甲基化 MH 9 {Lys(Me2)}　　　赖氨酸双甲基化 MH 10 {Lys(Me3)}　　　赖氨酸三甲基化 MH 11 {L-2-Me-Trp}　　色氨酸甲基化 MH 12 {D-2-Me-Trp}　　D-色氨酸甲基化 MH 13 {Tyr(Et)} 酪氨酸乙基化 MH 14 {D-Tyr(Et)}　　　D-酪氨酸乙基化 另外，甲基化多肽在多抗和单抗的开发方面也是一个重要工具． 欢迎来订购多肽 Q Q号： 2022382221 公司电话： 027-87687992 公司传真： 027-87687992 电子邮件： order@moonbiochem.com 公司网址： http://www.moonbiochem.com

1、尽可能是在蛋白表面 2、保证该段序列不形成α-helix 3、N,C端的肽段比中间的肽段更好 4、避免蛋白内部重复或接近重复段的序列 5、避免同源性太强的肽段 6、交联可以交联在N，C两端，选择依据就是交联在对产生抗体不太重要的一端 7、序列中不能有太多的Pro,但有一两个Pro有好处，可以使肽链结构相对稳定一些，对产生特异性抗体有益。 为了使生产抗体获得最佳效果，仔细地设计抗原多肽是很有必要的，设计应满足一个基本条件：在免疫过程中，该抗原既不会产生过强的免疫反应，同时又能产生出对感兴趣的蛋白有结合能力的抗体。尽管抗原设计是一个很复杂的课题，有诸多需要注意的细节，已超过了我们所能提供的范围，根据我们所积累的经验，有几点关键的基本设计原则可以提供给大家参考： 1、确定抗体的用途（应用）新开展一个研究项目，弄清楚所感兴趣的蛋白的一些基本特性是很有必要的，特别是如果知道蛋白的结构会对选择抗体易于接触和识别的识别区域有很大的帮助。然而，在没有这样精确的结构信息（多数是这种情况）的情况下，了解研究的用途（应用）会影响多肽设计的策略。例如：如果研究重点是集中在蛋白的不同区域，如C端或N端，或在一种特定状态下的蛋白，如磷酸化等，那么按照所需序列设计的多肽和产生的相应的抗体在应用上应该没有太大的困难，然而，蛋白的构象将影响抗体与其识别区域之间的相互作用。这种情况下可能存在的问题是如果在折叠的蛋白中，该识别区域被藏在蛋白的内部，抗体将无法接触到该区域。（无法产生相互作用）。 2、识别区域的选择原则一般说来最理想的抗原性识别区域应具备亲水、位于蛋白表面和结构上易变形性等特点。因为在大多数的天然（自然）环境中，亲水区域倾向于集中在蛋白表面，而疏水区域常常被包裹在蛋白内部，同样道理，抗体只能与在蛋白表面发现的识别区域相互作用，而当这些识别区域有足够的结构易变形性而转移到抗体可接触的位置时，将会与抗体间有很高的亲和性。 3、连续的与不连续的识别区域连续的区域是指由连续的氨基酸序列（残基）构成的识别区域。大多数抗体是针对连续识别区域的，抗体能与这类区域以很高的亲和力相结合表明这段序列不在蛋白内部。不连续的识别区域是代表有一定折叠的一段多肽序列，或是将两段分离开的多肽连在一起的抗体的识别区域。在某些情况下，针对这样不连续识别区域的抗体也能产生，只是用来免疫的抗原多肽必须具备与该不连续识别区域相似的二级结构，而序列的长度需要符合相关的要求。 4、基本建议为了避免识别区域隐藏在蛋白内部的风险，我们通常建议选择蛋白的N，C两端来产生的相应的抗体。因为在完整的蛋白中，N，C两端通常是暴露在蛋白表面的。然而，一定要注意膜蛋白的C端疏水性太强，不适合作为抗原。 5、序列的长度通常我们建议抗原多肽的序列长度在8-20个氨基酸残基之间，如果太短，就有多肽太特殊、所产生的抗体与天然蛋白之间的亲和力（结合能力）不够强的风险，同样，如果序列长度超过20，将有可能引入二级结构，所产生的抗体失去特异性的可能，而且肽链越长，通常合成难度增大，不易获得高纯度的产品。 6、载体蛋白交联的选择 基本原则：将载体蛋白加在远离抗体识别区域的一端，在序列中没有Cys的情况下在N或C端加上Cys为交联的首选方法。 7、常用分析软件 MacVecfor TM ;DNA star TM;PC-Gene TM ，从蛋白序列直接预测抗原表位。 欢迎来订购多肽 Q Q号：2022382221 公司电话： 027-87687992 公司传真： 027-87687992 电子邮件： order@moonbiochem.com 公司网址： http://www.moonbiochem.com

聚乙二醇修饰 　　聚乙二醇(PEG)是中性、无毒且具有独特理化性质和良好的生物相溶性的高分子聚合物，也是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一。聚乙二醇即PEG具有高度的亲水性，在水溶液中有较大的水动力学体积，并且没有免疫原性。当藕联到药物分子或药物表面时，可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子，改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产生空间屏障，减少药物的酶解，避免在肾脏的代谢中很快消除，并使药物能被免疫系统的细胞识别;明浩生物推出的PEG修饰有： 　　PEG2、PEG4、PEG8、PEG12、PEG24 　　PEG2000、PEG5000、PEG20K、PEG40K 其他侧链特殊修饰： 　　Arg(NO2)、Tyr(3-NO2)、Phe(4-NO2) 　　Tyr(3-Cl)、Phe(4-Cl) 　　Tyr(SO3H2) Ser(Butanoyl)、Ser(Octanoyl)、Ser(Palm)、Ser(Laury)、Ser(Myr) 欢迎来订购多肽 Q Q号： 2022382221 公司电话： 027-87687992 公司传真： 027-87687992 电子邮件： order@moonbiochem.com 公司网址： http://www.moonbiochem.com

武汉明皓生物科技股份有限公司坐落于武汉东湖高新技术区光谷生物城, 是由一批在生命科学领域具有相当丰富经验的归国博士及经验丰富的专家共同创办的专业的生物公司。武汉明皓生物始终以“一切以客户为本”为理念，致力于为从事生命科学研究的科研人员提供高质量的化合物，多肽，蛋白及抗体产品以及高效优质的生物技术外包服务。 武汉明皓生物科技股份有限公司重在以高品质高质量为基础，以高满意度的客户服务为立命之本。我们坚信我们良好的发展前景和不断完善的经营模式，会为更多的客户提供更完美的,更贴心的服务。 （1）普通线性肽，链长至120个氨基酸，毫克至克级，纯度可达99% （2）简单修饰肽：免费提供N端乙酰化，末端酰胺化 （3）C端：酰胺化（NH2），生物素标记 (用赖氨酸侧链连接)，PEG2(用赖氨酸侧链连接)， C-FITC(用赖氨酸侧链连接)，C-AMC N端：乙酰化（AC），生物素标记（Biotin），脂肪酸修饰(Pal, Myr)，罗丹明标记， N-FITC，N-5-FAM，PEG2 侧链：Lys(Me), Lys(Me2), Lys(Me3),Lys(Ac) 环肽：酰胺环、二硫键环 磷酸化：p-Tyr，p-Ser，p-Thr （4）蛋白交联：KLH，BSA，OVA （5）含特殊氨基酸肽：含有D型氨基酸及各种氨基酸衍生物 （6）不同纯度范围（粗肽、＞70、＞80、＞90、＞95、＞98、＞99 欢迎来订购多肽 Q Q号：2022382221 公司电话： 027-87687992 公司传真： 027-87687992 电子邮件： order@moonbiochem.com 公司网址： http://www.moonbiochem.com