泰克生物着力于为客户提供高质量，且具性价比的抗体药物前期发现技术服务。我们在药物抗体发现方面拥有10年的项目开发经验和心得，积累了充足的抗体定制和重组蛋白生产经验。基于噬菌体展示技术（Phage Display Technology）平台的服务，泰克生物能够为客户提供一系列包括但不限于兔源、鼠源、羊源、驼源及牛源等不同物种的单克隆抗体制备服务，及其配套的完整可追溯性文件体系。噬菌体展示技术（即：纳米抗体技术）是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，通常为M13噬菌体的P3蛋白，使外源基因随外壳蛋白的表达而展示到噬菌体表面的生物技术。噬菌体展示的优势在于其展示纳米抗体文库中变异抗体基因的多样性，各个重组噬菌体（常用噬菌体为M13噬菌体）表面展示出不同的抗原结合域，相较于传统杂交瘤方法，噬菌体展示技术在抗体基因展示与筛选层面则具有非常突出的效率优势（如杂交瘤融合效率一般<0.4%，即1000次融合细胞中，大概4个融合子；而噬菌体展示轻松可以获得108-109个正确抗体序列）。█ 噬菌体展示抗体文库构建服务 泰克生物可为客户提供驼源VHH纳米抗体库，scFv抗体库，Fab抗体文库构建以及筛选服务。其中VHH纳米抗体库，又称为驼源重链抗体文库，抗体分子量大小为15kDa，是驼源动物产生的特有的一种抗体。目前被广泛应用于CarT/Car-NK治疗性的驼源VHH抗体（又被称为纳米抗体）噬菌体展示发现路径如图1所示：图1基于噬菌体技术平台的驼源VHH抗体发现服务泰克生物还可以提供一系列的抗体验证服务，例如：通过GST pull-down或CO-IP策略检测展示的蛋白质与其他分子之间的相互作用或分离特定目标、抗原抗体BLI亲和力测定、细胞功能验证及细胞系体外验证等。泰克生物提供的纳米抗体库具有丰富的多样性和规模，是筛选所有抗原类型以及选择具有高亲和力的功能性抗体的理想选择。凭借多年的经验，我们开发了多种噬菌体平台，可以为您定制特定的纳米抗体文库。如果您有兴趣开展噬菌体展示抗体项目，或者其他相关服务，例如抗体测序、scFv、Fab和Fc 融合蛋白等，请联系我们！█ 服务内容和周期 步骤服务内容QC标准周期Step1:蛋白表达(1) 密码子优化+基因模板合成+表达载体构建；(2) 质粒抽提+转染（哺乳表达系统）目的蛋白检测（WB，SDS-PAGE）；(3) 蛋白表达放大+蛋白亲和纯化；交付：表达载体，克隆甘油菌，重组蛋白3-3.5mg，纯度>85%，标准实验报告 4-6周Step2:动物免疫(1) 动物免疫4次，加强免疫一针，共计免疫5针；(2) 免疫前采集阴性血清，第4针采血进行ELISA检测血清效价；(3) 若第4针血清抗体效价（蛋白抗原>105；多肽抗原>104）满足要求，则采血前7天再次加强免疫1针，如不满足要求，则继续常规免疫；(4) 效价合格，采血分离单核细胞；动物：背景清晰（年龄，性别，防疫情况）；免疫：蛋白抗原>105；多肽抗原>104；采血：数量100ml以上；PBMC细胞：>105/vial 8-10周Step3:模板cDNA制备(1) PBMC总RNA提取（RNA提取试剂盒）(2) 高保真RT-PCR制备cDNA（反转录试剂盒）cDNA：反转后>1ug/ul，胶图分布均匀；cDNA模板总量>150ug；1 天Step4:噬菌体展示文库构建(1) 以cDNA为模板，两轮PCR法扩增VHH基因；(2) 噬粒构建与转化： VHH基因拼接噬菌粒载体，电击转化TG1宿主菌，构建抗体库，混合建库电击次数不低于30次（单靶点建库，电击次数不低于15次）；(3) 鉴定：随机挑选24个克隆，PCR鉴定阳性率+插入率(4) 辅助噬菌体准备：M13噬菌体扩增+纯化；(5) VHH展示文库救援文库阳性率：>90%；文库插入性率：>90%；库容：>1081-2周Step5:文库筛选（3轮筛选）(固相筛选)(1) 抗原包被（单个蛋白筛选，常规默认是固相筛选法或磁珠分选；细胞筛选方法需要单独核算费用）；(2) 默认3轮筛选：压力筛选，最大限度去除非特异性抗体；(3) 挑取96个克隆扩增噬菌体+IPTG诱导表达+ELISA检测阳性克隆；(4) 挑取全部阳性克隆进行基因测序（>20个，多达96个）；ELISA阳性标准：P/N>3；VHH筛选标准：CDR氨基酸序列不同2-3周Step6:抗体验证（体外验证）(1) 将获得的抗体序列构建合适的表达载体进行表达+亲和纯化+抗体蛋白定量；(2) Elisa验证抗体与抗原结合，进行下游验证（交付EC50数据）;(3) BLI法验证抗体亲和力；(4) 细胞功能验证：流式验证；(5) 验证细胞系（抗原受体过表达细胞系）；交付：表达载体，克隆菌株，表达菌株，重组抗体蛋白1mg，纯度90%；快速亲和力测定结果；4-6周█ 服务优势 ✔ 物种适应性广泛：人，鼠，兔，羊，羊驼，骆驼，鱼等物种的单抗开发均兼容（不适用牛源单抗开发）✔ 技术平台成熟：噬菌体展示技术提供1级免疫文库的建库库容为108-109，插入率均满足>95%，筛选获得的抗体亲和力普遍处于nM- pM级别✔ 开发周期短：获得PBMC后，建库到筛选获得抗体序列，3-4周✔ 产品交付标准高：针对免疫库，交付免疫前后血清，抗体展示文库，筛选洗脱产物，抗体序列✔ 文库淘筛定制化（噬菌体展示方式）：根据客户需求不同以及靶点性质不同，会设计不同的筛选方法，如固相，固相/液相和细胞筛选✔ 实验记录可追溯：QC质控标准（含RNA提取，cDNA制备等），中英文实验报告，手写实验记录本 

泰克生物（Tek Biotech）经过多年的发展，积累了丰富的免疫学研究与检测经验，建立了完善的分子基础实验室平台。泰克生物（Tek Biotech）的酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system，Y2H）是由基于SMART法构建的文库、酵母菌株、严谨的报告基因、高表达载体组成的。酵母双杂交系统是一种在基因水平上使用遗传和分子方法来检测蛋白质之间相互作用的免疫学测试技术。这种方法只需要构建质粒，没有涉及蛋白纯化和抗体免疫阶段，同时又能方便快速地获得相互作用的蛋白质的编码基因。Y2H可以用来筛选与靶蛋白相互作用的蛋白基因序列，也可以研究已知蛋白间的相互作用原理。泰克生物（Tek Biotech）既能够提供蛋白互作检测服务，包括免疫共沉淀（Co-IP）、Pull-down等实验，实现对蛋白，小分子，抗体等相互作用的定性定量分析；也能进行ELISA、Western Blot等常用的免疫学检测技术。 酵母双杂交系统（Y2H）的原理：  图1 酵母双杂交系统原理DNA结合域（Bonding Domain, BD）: BD是一种能够与特定的DNA分子序列结合从而调节基因表达和自我复制的蛋白质结构域。DNA BD存在于转录因子等许多基因调控元件中，赋予这些调控元件识别并结合特定DNA序列的功能，从而达到对下游基因调控的目的。转录因子激活域（Activation Domain，AD）：AD是一段能够在在转录过程中激活基因转录的功能性蛋白质序列，常存在于转录因子蛋白质中。AD可以通过与其他调控因子的相互作用形成蛋白质复合物（转录因子、共激活因子和基因调控复合物等），从而使转录因子获得可以结合到DNA特定序列，然后招募其他转录因子和RNA聚合酶来启动转录的功能。因为每个转录因子只能结合到特定的序列上，所以这个过程是高度特异性的。在酵母双杂交系统中，将DNA BD和转录因子AD分别与Bait蛋白X融合和Prey蛋白Y形成融合蛋白。BD-Bait X融合蛋白可以识别并结合报告基因的上游激活子序列（Upstream Activation Sequence, UAS）。同时如果Bait X蛋白与Prey Y蛋白之间具有相互作用，这会使DNA AD与转录因子BD重新结合构成具有启动报告基因功能的结构域。酵母双杂交及系统是一种在细胞核中进行利用基因水平技术来鉴定和检测细胞核和细胞质蛋白之间相互作用的方法。同时，Y2H也可以使用蛋白质作为诱饵从所需的细胞类型、组织或整个生物体制备的蛋白质片段库来进行筛选，然后通过对所选酵母菌菌落中相应的质粒进行测序，从而确定相互作用。Y2H是在真核生物酵母中进行的，具有灵敏性高、功能强大、适用范围广等特点，现已被应用于多个研究领域。 酵母杂交检测服务的分类：为了研究蛋白质的相互作用，科学家根据传统的Y2H系统，开发了几种系统以适应不同蛋白质的不同亚细胞定位和生化特征。泰克生物（Tek Biotech）为客户提供多种系统的服务，以适应不同项目的不同需求。（1）酵母单杂系统（Yeast one-hybrid system，Y1H）：研究蛋白质-DNA相互作用。 图2 酵母单杂交系统原理酵母单杂交系统需要将Bait DNA序列整合到酵母基因序列中。将Prey蛋白构建到AD载体中，与转录因子GAL4的AD结构域融合表达。如果Prey蛋白能够识别并结合Bait DNA序列，Prey蛋白所融合表达的AD结构域就可以招募转录复合物以激活报告基因的表达。（2）酵母三杂交系统（Yeast three-hybrid system，Y3H）：研究两个蛋白质和第三成分（蛋白、RNA或小分子）间的相互作用。 图3 酵母三杂交系统原理在酵母三杂交系统中，将两个RNA结合蛋白X，Y分别于DNA BD和转录因子AD结合形成两个融合蛋白。第三种成分可以为这两个RNA结合蛋白X，Y提供两个特定的RNA靶点来连接两个融合蛋白。（3） 膜酵母双杂交系统（Membrane yeast two-hybrid system，Mb Y2H）：用于研究膜蛋白 图4 膜酵母双杂交系统原理泛素（Ub）是一种蛋白质，可以通过实验被分离成两个基团，并且当它们靠近彼此时，其功能又可以进行重构。在Mb Y2H系统中，将目标膜蛋白Bait融合到半个泛素（Cub，泛素分子被截断后的C端）上，并且Cub上还连有一个含有人工转录因子（TF），该TF由细菌LexA-DNA BD和单纯疱疹病毒VP16蛋白AD组成。将另一种目标蛋白Prey（膜蛋白或细胞质蛋白）融合到另外半个改造泛素（NubG/NubA，是将泛素分子被截断后的N端进行改造，从而降低Cub与Nub两者之间的亲和性，避免其发生自发重组现象）上。所以只有当结合在NubG/A的蛋白质和结合在Cub的蛋白质间相互作用时，才能使两个半个泛素分子结合形成可以被泛素特异性蛋白酶（UBPs）识别作用的完整泛素分子。然后在酶的作用下，连接在Cub的调控因子被释放进入细胞核中，从而结合在特定的DNA序列上来激活转录报告基因。 服务优势： -- 技术专家直接服务，满足不同检测需要-- 高准确度分析仪器，经验丰富的操作以及严格的质量管理，保证结果准确可靠-- 检测服务效率高，过程实时监控-- 检测仪器灵敏度高，样品消耗量低-- 实验周期短，节省等待时间-- 提供真正的一站式服务：从构建文库到阳性克隆的筛选，这样可提高效率，避免错误，从而为客户从客观上节省费用服务内容服务流程内容周期客户提供不少于2 μg的质粒（含诱饵靶基因）以及该基因的DNA序列，以便我们设计合成方案，进行人工合成（需收费）***创建BD-X诱饵将诱饵靶基因连接到Y2H载体中去，并测序；诱饵靶基因可以是一段基因（酶切）或全长基因6-8周通过BD-X诱饵测试自我激活测试诱饵基因的自我激活能力和毒性酵母双杂交筛选并获得识别猎物文库筛选和交互验证，阳性克隆的分离提取和DNA的测序交付阳性克隆若干及DNA测序结果，每个阳性克隆不少于2 μg质粒

泰克生物提供快速专业的抗体测序服务（包括：杂交瘤测序，抗体全场测序等），对编码杂交瘤细胞单克隆抗体重链可变 (VH)区域和轻链可变 (VL) 区域的基因序列进行测序。同时，泰克生物配备了先进的抗体全长测序技术，例如与串联质谱联用的液相色谱仪 (LC-MS/MS) 和配套的先进计算算法，可根据您的需求提供准确、快速的抗体全长测序服务。█ 杂交瘤测序服务泰克生物提供快速专业的杂交瘤测序服务，对编码杂交瘤细胞单克隆抗体重链可变 (VH)区域和轻链可变 (VL) 区域的基因序列进行测序。杂交瘤测序原理：杂交瘤技术是指建立杂交瘤细胞系的技术，其用于产生大量单克隆抗体，所以又称单克隆抗体技术。测序原理是通过RT-PCR技术从杂交瘤细胞中提取杂交瘤分泌的抗体序列进行分析。泰克生物可在4-6周内完成高通量（NGS）杂交瘤测序，并且为客户提供所有VH和VL序列以及一份完整的报告，告知客户杂交瘤细胞单克隆抗体的序列（包括单克隆抗体相对应的VH和VL序列的CDR区序列分析）和可能存在的任何异质性或其他抗体同种型。经过杂交瘤测序，可以获得相应的序列，在后续项目中有需要用到单克隆抗体的时候，可以利用测得的基因序列进行重组抗体的制备。解决了杂交瘤保存过程中，细胞死亡或高特异性丢失的问题。杂交瘤测序，对于进一步的大规模生产及抗体的人源化等生物工程操作同样具有重要的意义。杂交瘤测序服务流程 项目内容交付周期杂交瘤细胞抗体测序服务RNA提取反转录PCR扩增VH和VL序列测序验证基因合成表达载体构建抗体VH和VL序列分别含有VH和VL基因的表达载体(质粒构建QC)3-4周服务优势 ✔  适用于任何物种✔  使用随机引物，不会引入突变✔  识别所有 VH 和 VL 序列并量化它们的相对丰度✔  序列绝对保密性✔  高通量方法可同时对多达 50 个杂交瘤进行测序 - 提供批量杂交瘤测序包✔  序列在 3-4 周内交付█ 抗体全长测序 有许多单克隆抗体无法获得杂交瘤细胞系。为了满足客户的对未知抗体序列（无杂交瘤细胞系）的测序要求，泰克生物还提供抗体全长测序服务，通过将质谱与从头肽测序和重叠肽组装相结合，确定可变域的氨基酸序列。抗体的全长测序是指在事先不知道DNA或蛋白质序列的情况下，推导抗体的氨基酸序列并发现任何相关的翻译后修饰的分析过程。泰克生物保证提供功能性抗体序列以及具有完整序列覆盖率的综合测序报告。基于重组抗体瞬时表达服务，泰克生物可以在短短9周内对抗体进行测序并交付相应的重组蛋白。样本要求 样本量：100μg单克隆抗体蛋白浓度：>0.2mg/mL纯度：目标抗体占总蛋白量的95%以上其他：无相同抗原的抗体蛋白服务内容质谱测序抗体表达周期交付酶消化成重叠肽；使用 Thermo Orbitrap 的 LC-MS/MS肽的从头鉴定；肽组装；基因合成克隆HEK293 细胞中的瞬时表达亲和纯化缓冲液交换 (PBS)无菌过滤纯度 >98% (SDS-PAGE)内毒素 < 1 EU/mg9周综合测序报告；>2 mg 纯化抗体；QC报告服务优势✔  快速：测序可在10个工作日内完成✔  高通量：我们的 DASS 方法是高通量兼容的✔  专业：科学家负责每个项目，并配备专业团队在过程的每个步骤进行质量控制；专家研发团队致力于优化协议以提供更高质量的数据✔  个性化：定制服务包括但不限于抗体设计、克隆、从头测序和分析，以及体外优化以满足您的需求✔  准确性高：单独肽的多个质谱读数中获得了强信号峰特征，可以正确识别序列中的每个氨基酸。✔  应用范围广：可用于所有类型的抗体（除了人类）。甚至已被用于对受污染或结合的抗体或成对具有不同轻链的抗体进行测序。✔  信息丰富：抗体从头测序通常会导致检测到测序中的意外差异或蛋白质分子上的新糖基化位点，而DNA测序无法检测这些差异。