近年来为建立一种逐渐发生发展的心肌梗塞模型,较为广泛地使用了一种遇水膨胀的纤维素环(Ameriod),这种纤维素环套在预期闭塞的冠状动脉上,环外边以金属圈(如不锈钢)固定起来,手术后两周或更长的时间内可将冠状动脉逐渐闭塞。这种模型制造较易,动物生存率高。但即是使用这样的方法,仍然缺乏人类的动脉粥样硬化的病理学基础。近来有报告指出,家猪可以喂饲高脂饮食形成冠状动脉的粥样硬化,引起心肌缺血,又可以通过改变饮食或治疗使动脉粥样硬化的斑块消退。看来,这是值得注意探索的目标。国内有关心肌缺血和心肌梗塞模型的复制方法:1.电刺激法 是近年建立的一种造成动物实验性心肌缺血的较新方法。实验一般用成年雄性家兔,麻醉后用定向仪插入两支涂绝缘漆的不锈钢针,以弱、强刺激(弱刺激为0.8～1.6mA,强刺激为4～8mA)交替刺激右侧下丘脑背内侧核,每次刺激5分钟,间隔1～3分钟。2.药物法 亦为近年来采用的一种方法。最常使用的造型药物为4%异丙基肾上腺素,给大鼠皮下注射50mg/kg体重;或将药物加入500ml盐水中从家兔耳静脉匀速(4小时)滴入,每公斤体重可分别给药10、20、30mg,或直接将药物注入腹腔均可造型。也可用麻醉犬静脉给予麦角新硷0.2mg/kg 体重,造成冠状动脉痉挛。3.冠脉阻断法 结扎冠状动脉是制作心肌梗塞模型的最常用方法。一般选用成年健康犬或家兔,麻醉后开胸,多结扎其冠状动脉前降支阻断心肌供血,引起病变;也有人采用闭胸式选择性冠状动脉插管法,即在荧光屏下将心导管由麻醉犬的颈动脉切口处插入,沿主动脉壁直抵左窦底部,将其尖端送至左冠状动脉内约2cm深处,向导管内注入120mg/kg体重的汞,形成急性心肌梗塞。亦有人用冠状动脉周围套线牵拉法使其不完全阻断,以形成家兔急性缺血性濒危心肌模型。为了更接近自然状态下心肌缺血的变化,近来有的单位用清醒犬作急性缺血和梗塞模型。先将犬麻醉,然后分离冠状动脉长约10毫米,套上冠状动脉压迫环,用注水压迫阻断冠状血流,观察犬在清醒状态下的心肌缺血反应与药物效应。此外,还有用离体大鼠心脏冠脉结扎复制出超微结构的心肌缺氧损伤模型。实验热线：19931682702（同微信）

染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。常见问题:1.ChIP是什么?答:染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。2.ChIP有哪些应用?答:近年来由于该技术不断的发展和完善,其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用,发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用,发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰,发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。3.ChIP技术的原理?答:生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多,结果的重复性较低,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。4.做ChIP试验,必须做甲醛固定么?答:不一定,视样品及试验方案而定。做甲醛固定的为X-ChIP,而不需要固定的为N-ChIP。甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。5.为什么必须将DNA切碎至少于1000bp大小(大约3个核小体 ~400-500bp)?答:为确保ChIP实验有良好精度。若您的平均片段长度大于1000bp,您将会分离获得包含您目标序列的DNA,但所要研究的蛋白会离您目标序列有700个核苷酸的距离。6.为什么使用鲑鱼精子DNA来封闭琼脂糖珠子?为什么我的样品中鲑鱼精子DNA不会发生PCR反应?答:鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。实验者不太可能对鲑鱼组织做ChIP实验,所以此DNA不会因交叉杂交而被PCR引物扩增。7.引物最佳设计是什么样的?答:引物长度应为24个核苷酸,应含有50%GC碱基对,Tm值为60°C。不要扩增大于600-800个核苷酸的序列。不必考虑基因组内不独一序列。8.您推荐下如何从琼脂糖(或琼脂糖凝胶)中洗脱抗体-蛋白-DNA复合物,用来做re-ChIP试验?答:在ChIP分析试剂盒内可找到洗脱缓冲液,用它洗脱复合物。对于re-ChIP,有必要添加蛋白酶抑制剂到免疫沉淀洗液和洗脱缓冲液,及第二轮实验用的稀释缓冲液。请确定所有溶液处于低温,蛋白质不会因此而在收集第一次免疫沉淀的复合物或第二次免疫沉淀时降解。9.蛋白A琼脂糖能被用于小鼠IgM?答: 蛋白质A不能与小鼠IgM结合。可以考虑用一个桥接抗体连接。10.在做ChIP之前,有办法纯化细胞核么?答: 在细胞与甲醛交联后,细胞核可通过“溶胀缓冲液”培育及剪刀细胞均质器(dounce homogenization)制备(至少10倍体积)。   溶胀缓冲液:   25M Hepes, pH 7.8   1.5mM MgCl2   10mM KCl   0.1% NP-40   1mM DTT   0.5mM PMSF   蛋白酶抑制剂混合剂   然后按照protocol在SDS裂解液中裂解11.ChIP超声波的最佳条件?答: 1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。   2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。   3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。   4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。   5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。   6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。12.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:13.ChIP超声波的最佳条件?答: 1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。   2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。   3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。   4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。   5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。   6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。14.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:15.什么是input DNA? Output DNA?从染色质上获得的未做过IP的已经被逆转交联的DNA. 它是检查PCR是否有效的对照。Output DNA是来自每次IP实验的DNA.其实就是genomic DNA. 在ChIP实验中, sonication 或酶解后, 样本取部分不做IP, 直接逆转交联. 它的最主要的作用就是检查PCR系统是否work. 通常情况下, 在该条道中,都可以看到条带的.如果没有,说明PCR系统不work.16.为什么ChIP试验需要用经验证的抗体?抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的,有的抗体识别的抗原表位比较小,不容易暴露,在ChIP实验中容易被DNA包裹,从而使抗体无法结合,因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的,商业化的抗体都应该是验证过的。17.什么是reChIP技术?ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为 通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作

模型制作方法:SD大鼠,7日龄,体重12-16g,雌雄兼用。模型组动物麻醉,结扎左侧颈总动脉,缝合切口,放回原饲养环境中回复2小时,置动物于2000ml密闭容器中,通入含有8%氧气的混合气体,流量为3l/min。2小时后恢复正常供氧。制成左侧大脑半球缺氧动物模型。观测指标与分析:(1)脑组织病理学检查;(2)脑组织细胞凋亡检测;(3)闹组织缺氧诱导因子(HIF)-1amRNA表达水平检测;(4)脑组织半胱天冬酶表达水平的检测;(5)脑组织碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达的检测;(6)脑神经干细胞的检测;(7)脑组织胶原纤维酸性蛋白检测;(8)脑组织c-fos基因表达水平;(9)学习、记忆功能检查;(10)脑组织单胺类神经递质含量测定;(11)脑组织MDA和SOD水平测定;(12)脑纹状体组织Par-4蛋白表达水平检测;(13)脑组织钙离子含量测定;(14)热休克蛋白70表达水平检测;(15)脑组织白介素-1β含量测定;(16)脑组织一氧化氮含量测定。实验热线：19931682702（同微信）

肿瘤细胞皮下接种成瘤模型操作流程: 1. 挑选合适成瘤的细胞进行培养; 2. 按照一定的细胞量(1×106-107cells)注射裸鼠; 3. 饲养裸鼠至肉眼可见瘤体; 4. 测量瘤体大小(长径,短径,连续2-4周,2-3天一次); 5. 裸鼠拍照、摘取瘤体,进行后续处理。

B16小鼠黑色素瘤人工肺移植模型【实验原理】 B16是C57BL/6小鼠耳根部皮肤上发现的自发性黑色素瘤,以后又在该瘤株中筛选出肺部高转移的集落株,小鼠静脉内移植后主要形成肺转移瘤,肺外转移极少。该瘤细胞注入静脉内,在短时间内直接把大量瘤细胞输入血液循环,不经过癌转移的前几个过程,故称为“人工转移”模型,以区别于“自发性转移”模型。该模型体现了肿瘤细胞进入血液循环后癌转移的几个步骤,对于研究肿瘤细胞在循环系统中的生成能力,瘤细胞附着、穿越靶器官血管的能力和探讨癌转移的器官特异性则有其独特的优势。【操作步骤】 取体外对数生长期的B16小鼠黑色素瘤细胞,经胰酶消化,以磷酸缓冲液配置成瘤细胞悬液,浓度为2.5*105/ml,,相应宿主尾静脉接种0.2ml/只。随机分组进行实验,3周后以颈椎脱臼法处死小鼠,称小鼠体重,剖取肺,称肺重,用解剖显微镜计数各肺叶的转移集落数,转移集落成黑色或灰黑色,相互间不融合。【结果计算】 计算给药组平均肺集落数与阴性对照组的平均肺集落数,计算肺转移抑制率。实验热线：19931682702（同微信）

细菌16S rDNA菌种鉴定16S rDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因。 长度约为1500pb,是细菌分类学研究中最常用、最有用的"分子钟16S rRNA其大小在1,500 bp左右,所代表的信息量适中,因此是进行分类研究的理想材料。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rRNA基因,并进行DNA测序,与GenBank中的已知序列进行同源性比较后,判定细菌种类,将细菌划分到属或种服务要求:1. 请提供基因组DNA、经菌种分离后带有单菌落的新鲜平板或斜面。2. 基因组DNA的浓度≥10 ng/μl,总体积≥20 μl,且无明显降解;平板或斜面应长有分离的单菌落。3. 由于革兰氏阳性细菌或厌氧菌、放线菌等特殊菌株,请在服务委托书中加以说明。4. 如果测序结果出现如下套峰,视为样品不纯,本公司将收取全额实验费用。并建议克隆多个测序鉴定。服务基本流程:1. 进行引物设计合成;2. PCR扩增16S rDNA;3. PCR产物纯化;4. 测序,序列比对分析。服务报告内容:实验报告包括PCR产物照片、NCBI序列比对鉴定结果、测序报告、序列碱基图、以及剩余模板(可保存1个月);16S rDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因。 长度约为1500pb,是细菌分类学研究中最常用、最有用的"分子钟16S rRNA其大小在1,500 bp左右,所代表的信息量适中,因此是进行分类研究的理想材料。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rRNA基因,并进行DNA测序,与GenBank中的已知序列进行同源性比较后,判定细菌种类,将细菌划分到属或种实验热线：19931682702

6-OHDA损毁MFB造成的大鼠PD模型有两个明显的弊端:一是神经元急性死亡。6-OHDA注入后15分钟即可检测到DA含量的下降,在第30-60分钟时更加明显,3-5天内绝大多数神经元死亡。二是损伤严重。经APO诱发旋转7圈/分以上者,黑质内多巴胺能神经元的死亡率已经超过90%。可见这种模型对于研究多巴胺能神经元慢性进行性病变的全过程不甚理想。但由此得到启发,人们发现机械损伤MFB同样可以造成黑质内的多巴胺能神经元变性坏死,并且这种变化呈现慢性、进行性过程。已经建立的造模方法有MFB轴突切断术(medial forebrain bundle axotomy)和中脑半切术(hemitransection of midbrain)。(一)大鼠MFB切断术:1.操作步骤Wistar大鼠,雌性,体重185-210g。常规注射水合氯醛麻醉后,置于Kopf立体定位仪上固定。切开皮肤,暴露颅骨前囟。选择部位在前囟后3.8mm,中线旁开2.4mm处打孔。将Kopf公司(Kopf Instruments,Tuyunga,CA,USA)生产的可伸缩电线刀(retractable wire knife)垂直伸入孔内达颅骨平面下8mm处,固定外套管,将电线刀的刀刃由外套管中推出2.0-3.0mm。上提电线刀约2.5mm,然后下放回原处。再重复一次,以保证MFB充分切断。然后回收刀刃,退出电线刀。缝合皮肤(Lapchak PA等,1993)。2.模型检测(1)旋转行为学检测:术后4周,将大鼠腹腔内注射AMPH(5mg/kg)诱发大鼠旋转。计数90分钟内的旋转次数。(2)其它检测:病理和生化检测与6-OHDA损毁模型同。(二)中脑半切术(hemitransection of midbrain)1.操作步骤SD大鼠,雌雄不拘,体重200-250g。常规方法麻醉,立体定位仪上固定和暴露颅骨前后囟。在前囟后1mm,中线旁开0.5mm处打孔。将以特制的4mm宽的刀,沿与颅骨成68度角的方向,斜插入9mm,然后将刀退出。缝合皮肤。(Toffano G等,1984)2.模型检测(3)旋转行为学检测:术后8周,皮下注射APO(0.25mg/kg),诱发大鼠向健侧旋转。(4)其它检测:病理和生化检测与6-OHDA损毁模型相似。

酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。复性原理:在电泳过程中,SDS与样品中的MMPs结合(当然是可逆性结合),破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用,而只有当将胶置Trition中洗脱(最好是放在摇床上摇,30min/次,做2次或15min/次,4次。静置于Trition中是不妥的。)时,由于SDS被Trition结合而去除,从而使MMPs恢复了活性。

模型制作方法 Wiistar大鼠,体重230-250g,雄性。(1)肝硬化模型复制:用40%四氯化碳油溶液每个3天进行背部皮下注射,同时辅以低蛋白、低胆碱、高脂肪、高胆固醇饮食。实验第6周时形成早期肝硬化;实验第九周时进入中晚期肝硬化阶段。(2)小剂量内毒素注射诱发肝性脑病:肝硬化动物于实验第9周时进行腹腔注射一次性小剂量注射大肠杆菌内毒素,注射剂量:300微克/100g体重。注射后1h、2h、3h、4h分别测定大鼠脑电图和观察动物一般行为状态变化,以此判断有无肝性脑病的发生。另设单纯内毒素注射组(正常大鼠腹腔内注射同等剂量的内毒素)、正常组及肝硬化对照组,后两组腹腔内注射同等剂量的无菌生理盐水。所有动物均于同一时间注射,注射前禁食过夜。观测指标与分析(1)内毒素注射前后动物症状及电脑图检查;(2)血浆内毒素、血氨、血浆胰高血糖素含量测定;(3)血液与脑内谷氨酰胺含量测定。实验热线：19931682702

克隆形成试验可反映细胞群体依赖性和增殖能力。一般细胞在体外增殖六代以上,其后代形成的细胞群体称为细胞集落或克隆。每个克隆由单一细胞而来,含有50个以上细胞,大小在0.3-1mm之间。通过克隆形成可检测各种理化因素对细胞克隆形成能力的影响。平板克隆形成试验可检测贴壁细胞细胞的克隆形成能力,软琼脂集落形成试验可检测非锚着依赖生长的细胞,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系等。基本步骤:1、取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。3、经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%流程:1) 项目方案的确定,包括目的细胞、细胞处理方式及处理时间等。2) 细胞培养3) 克隆形成实验4) 克隆形成实验图片及实验报告实验热线：19931682702（同微信）