斑马鱼CRISPR基因编辑技术服务，含基因敲入品系制备、基因敲入品系制备、转基因品系制备等。斑马鱼基因敲入品系制备服务简介：1. 基因敲入(Knock in)非同源依赖的DNA修复技术，在斑马鱼基因组定点插入外源DNA片段（荧光蛋白、PA等）。2. 基因敲入技术特点    2.1 定点插入；    2.2敲入效率较低。服务流程：根据客户基因敲入要求进行基因分析；cas9 mRNA和多个gRNA靶点的设计及合成；高效gRNA靶点的筛选及效率验证；敲入载体设计及构建；斑马鱼胚胎的显微注射和敲入验证；F0代斑马鱼的可遗传性筛选；杂合子F1代斑马鱼的基因型鉴定。环特生物优势：国际一流的斑马鱼敲入技术以及上百例的成功经验；特有的高效筛选方法。案例展示：斑马鱼基因敲除品系制备服务简介1.基因敲除(Gene Knockout)根据给定GeneID或Gene name，分析基因保守结构域，在保守结构域或客户指定区域设计靶点并制备靶点gRNA，gRNA和Cas9共注射使基因产生移码突变，通过PCR筛选得到稳定遗传品系。2. 基因敲除技术特点    2.1 通过将基因敲除斑马鱼品系与野生型相比较，研究者可以揭示特定基因的功能。    2.2 在基因组水平上将目标基因敲除，遗传背景干净清晰，是研究基因功能的金标准。服务流程▲根据客户提供的GeneID或Gene name进行基因分析——▲cas9 mRNA和多个gRNA靶点的设计及合成——▲高效gRNA靶点的筛选及效率验证——▲F0代斑马鱼的可遗传性筛选——▲杂合子F1代斑马鱼的基因型鉴定环特生物优势成熟的基因敲除技术快速获得稳定品系；多靶点共注射F0代验证基因功能。斑马鱼敲除品系成功案例1、基因分析分析目的基因的保守结构域；2、靶点筛选设计4个gRNA靶点，PCR检测包含靶点的区域真实序列，显微注射验证靶点效率；3、大规模注射养殖F0Cas9 pro+gRNA 共注射，共养殖 F0 约 80 条用于后期Founder筛选；4、Founder 筛选 F0代斑马鱼与野生型外交，收集48hpf的F1胚胎抽取基因组，PCR鉴定，测序结果在靶点位置出现双峰的认为产生突变，然后TA clone验证其可能产生的突变方式；5、F1 代筛选F1代斑马鱼剪尾筛选，TA clone验证突变方式：通过对测序图谱的分析获得突变方式为：-5bp，产生移码突变的敲除斑马鱼；通过对测序图谱的分析获得突变方式为：-4-3bp，产生移码突变的敲除斑马鱼模型。斑马鱼转基因品系制备服务简介1. 转基因斑马鱼转基因技术包括显微注射、电穿孔技术（电脉冲介导）、精子载体法、GAL4/UAS 转录激活系统、Tol2转座子介导、拟型反转录病毒介导、重组杆状病毒介导等方法。2. 转基因技术目的    2.1 通过定点敲除技术进行基因鉴定和功能研究；     2.2 利用报告基因对受体等蛋白质进行功能研究；    2.3 构建各种斑马鱼突变体，通过斑马鱼疾病模型进行人类疾病研究和药物筛选；    2.4 构建含有特异性启动子的生物感应器，用于环境监测。3. Tol2转座子介导的转基因技术优点    3.1 Tol2转座子可携带大片段DNA；    3.2 Tol2转座子没有位置偏好性，几乎能整合到染色体的任意位置；    3.3 Tol2转座子的耐受范围很广；    3.4 Tol2作为天然的具有自主转座活性的脊椎动物转座子，能够在胚胎发育的不同时期进行有效的转移；    3.5 Tol2转座子介导的转基因技术能够有效克服外源基因在后代传递频率低的技术难题。服务流程▲客户提出转基因品系制备需求→▲分析可行性→▲构建载体→▲斑马鱼胚胎注射→▲founder筛选→▲F1代斑马鱼养殖→▲F2代斑马鱼养殖环特生物优势1.特有的养殖方法可缩短服务周期；2.丰富的经验和及时沟通助力科研实验。参考文献：[1] 刘丽丽, 王健, 王海胜,等. 斑马鱼转基因平台的建立[J]. 生物技术通报, 2013(010):120-126.[2] 陶然, 常玉梅, 李世国,等. Tol2转座子的特性及其在转基因鱼类中的应用[J]. 水产学杂志, 2014, 000(001):60-64.

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服务项目环特CRISPR/Cas9基因编辑技术，可构建转基因、基因敲除（KO）、基因敲入（KI）、点突变（PM）等各类基因编辑小鼠模型，为客户提供现大小鼠模型定制、联合研发等服务。找大小鼠基因编辑公司，选环特生物，一站式大小鼠基因编辑服务！大小鼠基因编辑定制流程图：技术介绍Cas9/gRNA复合物在靶位点进行切割，产生双链断裂，迫使细胞进行紧急修复。通常条件下，细胞偏向于使用非同源末端连接的方式对断裂的双链进行修复，进而造成靶位点基因的插入/缺失突变。CRISPR/Cas9技术采用独特的受精卵处理方式让受精卵偏好同源重组修复路径，大大提高同源重组效率，使得DNA大片段敲入（KI）及条件性敲除（CKO）得以实现。四大优势● 周期短，效率高； ● 高嵌合率，生殖遗传稳定； ● 可实现DNA大片段敲入； ● 可实现条件性敲除。服务流程和周期：基因敲除小鼠模型构建完全性基因敲除小鼠通过CRISPR /Cas9基因敲除技术，针对靶基因设计和构建gRNA与Cas9表达质粒，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。条件性基因敲除小鼠通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出有两个floxed小鼠。该floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前，该基因表达正常；当floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因，而在其它组织或细胞中该基因表达正常。▲小鼠基因敲除（Cas9-KO）方案图基因敲入小鼠模型构建利用CRISPR/Cas9基因敲入技术，针对靶基因设计、构建相应的 gRNA质粒和donor vector，通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组，引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达；也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同时发生。▲小鼠基因敲入（Cas9-KO）方案图CRISPR/Cas9基因敲入小鼠包括：点突变、片段基因敲入。▲点突变（Cas9-PM）方案图转基因小鼠模型构建制作转基因大小鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。DNA原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的基因组中，并稳定遗传给后代。 四大优势● 更高的整合效率和目的基因表达概率； ● 更大的目的片段的插入； ● 更“精确”拷贝数的插入； ● 可自由移除插入片段。服务流程和周期质粒或BAC载体构建（2~3周）→ 原核显微注射：大小鼠（3周）→ 大小鼠的鉴定（1~2周）。建立转基因大小鼠品系系原则与流程1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组，因此首代转基因鼠（F0）将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不 同的首代转基因鼠中也不同。因此，每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究，并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中 一条染色体上，属于半合子，其后代只有一部分个体带有整合的基因，需要进行筛选鉴定。2、 原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。3、 F0代鼠达到性成熟后（8周）与野生型鼠进行交配，获得F1代鼠。4、 对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定，理论上，F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠，50%为野生型鼠。转基因小鼠类型● 过表达转基因小鼠； ● RNAi转基因小鼠； ● microRNA转基因小鼠； ● 可诱导性/组织特异性转基因小鼠； ● 可诱导性/组织特异性转基因小鼠。全新基因编辑Immediate-Phenotype技术全新基因编辑Immediate-Phenotype技术可实现三个月内拿到超过100只有表型小鼠，并可得到靶标基因所带来的表型变化，同时实现长达50KB片段基因编辑。目前我们可实现基因敲除 、基因敲入和点突变的Immediate-Phenotype，尤其是点突变技术在遗传性疾病发现和疾病研究上有重大意义，可快速实现罕见病的定性。在商业价值上，可实现生产成本和时间成本大幅降低。 服 务 咨 询 更详细的基因编辑服务内容，请拨电话咨询：0571-83782130，手机 17364531293（微信同号）。环特拥有实验动物生产和使用许可证，已通过CNAS、CMA、AAALAC认证，自有8500m²动物试验实验室。