葡聚糖凝胶 LH-20使用说明Sephadex LH-20 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20  是由葡聚糖 G-25羟丙基化而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等， Sephadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，即可用于初步纯化步骤，也可用与最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。1  层析原理 :Sephadex LH-20 的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱，  Sephadex LH-20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。2  特点 :适合用有机溶剂分离嗜脂性分子，可以非常经济地大规模制备各种天然产物结合凝胶过滤、分配色谱及吸附性层析于一身，分离结构非常相近的分子载量可高达 250mg样品 /ml凝胶，极少需要再生，分离效果可保持十几年不变3 Sephadex LH-20 性质胶 粒 形 状： 球形多孔颗粒大小（干）： 18-111μ m排 阻 极 限： 4-5KD(球蛋白 )尺寸 排阻 模式： 小于总体积的 20%正相 分配 模式： 小于总体积的 1%最大 线性 流速： 18000px/h参考 线性 流速： 1500px/hpH 稳 定 性： 2-11上 样 量： 取决于所需分辨率化 学 稳 定 性： 在许多水溶液中稳定有机溶剂系统中稳定操 作 温 度： 4℃ -4 0℃ 4 上样量视被分离物的结构性能的差异而定－差异大，则大；差异小，则小。  凝胶过滤的上样量一般为 5－ 7％的床体积，我们建议初次上样量控制在 1－ 2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考 TLC的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。流动相 的常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷   上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。   溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的，二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。   甲醇通常对带环状 (包括苯环 )物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。 LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。5 使用方法：将干粉浸泡于 60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态不间隙装柱，绝对不能出现凝胶断层（否则要重新装柱），动态用一倍柱体积的 60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止，如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高 .如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。6 葡聚糖凝胶 LH-20 洗脱溶剂。葡聚糖凝胶 LH-20 洗脱溶剂分为两类：反相和正相两种。用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用 100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用 50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用 100％甲醇冲柱。7 样品的处理和洗脱溶剂的选择。如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（必须要进行过滤！否则把 Sephadex LH-20 堵塞，就必须将 Sephadex LH-20 的柱头部分弃去，造成不必要的浪费）。如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。8. 葡聚糖凝胶 LH-20的步骤。 (1) 选择条件： 梯度洗脱在葡聚糖凝胶 LH-20使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统 ;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇 系统，用了很多年，效果较好。 (2) 饱和层析柱： 用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体积的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。 (3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。 (4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。 (5) 洗脱：控制流速，一般 1drop/s以下，可参见厂家的一些参数 ;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。 再生以备下次使用。

葡聚糖凝胶 G-15（ Bio-sep G-15）产品说明     葡聚糖凝胶是一种具有三维网状结构的高分子化合物 , 它是由葡聚糖加入交联剂环氧氯丙烷通过醚键互相交联聚合而成的，交联度越大，网孔结构就越紧密，吸水后的体积膨胀就越小，能允许进入凝胶内部的分子的分子量也就越小，反之亦然。层析时，大于凝胶孔径的大分子，被阻于凝胶相外，沿着凝胶颗粒之间的间隙走，下移速度最快，故最先洗脱下来，中分子物质部份进入凝胶内部，洗脱速度为其次，而小分子物质因全部进入凝胶，受到阻力最大，故最后被洗脱下来，如此物质得到分离。  1 化学和物理性质    葡聚糖凝胶 G-15 是一种球状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。型号 G 表明每克于凝胶吸水量的多少， G-15 表明每克干凝脱胶吸水 1.5毫升。这表征了凝胶所能膨胀的倍数，亦间接表征了凝胶孔径的大小。 葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。1.1 化学稳定性   葡聚糖凝胶 G-15 不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。它在水、盐溶液、有机溶剂、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。1.2 物理稳定性   葡聚糖凝胶 G-15 并不熔融，可以在湿态、中性 PH 进行灭菌或在高压灭菌器 120℃、 30 分钟而不影响它的色谱性质。干态的凝胶加热至 120 ℃以上将开始焦糖化。2 产品说明                                                                                                                     产品名称粒径 (UM)分离范围耐压 (Mpa)最大流速（ cm/h ）    排阻极限G -1540-120100-15000.30 480脱盐、交换缓冲液以及小分子蛋白的分离                2.1 交联葡聚糖凝胶微球 G-15 的脱盐实验研究固定上样量 50μl ，分别以 15, 30, 60, 90 cm/h 的流速洗脱，色谱图如图所示：    流速 375px /h ，进样量 50μl              流速 750px /h ，进样量 50μl    流速 1500px /h ，进样量 50 μl              流速 2250px /h ，进样量 50 μl3 使用方法3.1 乙醇浸泡  在室温下，将干粉浸泡于 50-60% 乙醇中至少 24 小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用去离子水洗去残存的乙醇滤干。3.2 去离子水浸泡   室温下，在去离子水中充分溶胀 24 小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀。3.3 盐酸浸泡    在常温下再用 0.2N HCl 浸泡 12 小时，间隙搅拌，滤干，水洗至中性。3.4 装柱  将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层。3.5 平衡   上样前平衡层析柱至少 3-5 个柱体积直到基线变得平稳为止（流出液的 PH 值等于上柱的 Buffer 的 PH 值）3.6 上样    凝胶过滤的上样量一般为 5% 的柱床体积，我们建议初次上样控制在 1-2% 的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到 20% 的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在 40-50 cm以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为 5 ： 1 即可。3.7 洗脱方法   可以用去离子水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱 Buffer 中加入 NaCl 等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化。3.8 在位清洗（ CIP ）凝胶使用十次后作一次 CIP ，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以 1000px/h 用 1M 氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。