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实验原理基因的化学合成即人工合成寡核甘酸片段,通过PCR拼接的方法,获得所需要的基因表达序列或者启动子等功能性元件片段。基因化学合成使合成任何基因序列成为可能。实验流程

实验原理早期的shRNA载体多采用RNA聚合酶III型启动子介导shRNA的表达,RNA聚合酶III型启动子如鼠源的U6启动子和人源的H1启动子可以在哺乳动物细胞中表达小分子RNA。随着miRNA干扰机制的深入研究,发展出第二代shRNA载体,即采用RNA聚合酶II型启动子CMV表达含侧翼序列的miRNA模拟物。该载体模拟miRNA的加工,表达出来的shRNA进入RISC沉默复合物的效率要比RNA聚合酶III型启动子表达的shRNA高数十倍,抑制效率更好,且可以和EGFP协同表达,方便观察转染效率。实验流程

体外定点突变技术通过PCR等方法向目的DNA片段中引入所需变化,包括碱基的添加、删除、点突变等。此技术能迅速、高效的提高DNA所表1  基因定点突变体外定点突变技术通过PCR等方法向目的DNA片段中引入所需变化,包括碱基的添加、删除、点突变等。此技术能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征,是实验室中改造、优化基因常用的手段,也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有力工具。可根据不同的研究目的,为您量身定做不同的实验方案。1基因定点突变服务特色a.  可对任何位置的位点进行突变。b.  可对含有重复序列或高GC序列进行突变。  提供结果a.  高纯度质粒,总量约2μgb.  含有重组质粒的菌液c.  测序原始图谱和序列d.  实验报告(实验流程、质控点)2  PCR定点突变实验原理PCR定点突变是根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物,通过PCR向目的DNA片段中引入所需的变化,如碱基的插入、删除、替换等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征,是基因研究工作中一种非常有用的手段。实验流程

提供基于Ion torrent平台的基因检测服务:快速准确地得到多个基因,多个样本的基因突变情况, 为疾病的诊断,治疗提供基因水平的参考意见。。肿瘤基因靶向测序a.  Cancer Hotspot Panel V2:靶向50个原癌及抑癌基因,覆盖约2800个已知外显子突变位点,最高4000 X测序深度。b.  Comprehensive Cancer Panel:靶向409个引用次数最多及突变最频繁的关键原癌及抑癌基因,350 X以上测序深度。c.  BCRA1/2 Panel:特异性针对乳腺癌/宫颈癌BCRA1/2检测,1000 X以上测序深度。Angelina Jolie通过基因诊断降低乳腺癌发病风险引起全球热议。d.  Colon and Lung Cancer Panel:特异性靶向结肠癌、肺癌相关22个基因热点区域,1500 X以上的测序深度。遗传病基因检测:Inherited Disease Panel:涵盖 700多种常见孟德尔遗传病相关的328个基因当基因组位置的测序覆盖度>20x时,生殖细胞系突变检测>90% 神经肌肉疾病涉及237种疾病中88个基因心脏病涉及143种疾病中61个基因发育疾病涉及143种疾病中61个基因代谢疾病涉及44种疾病中28个基因其他典型遗传性疾病涉及196种疾病中75个基因。定制化靶基因测序:我们还可采用Ion AmpliSeq™ Custom Panel:根据研究兴趣设计并定制目的基因的测序服务,可灵活选择测序深度。目前已经给多个医院客户做过多个大型定制化服务。1 微生物多样性测序产品介绍微生物多样性测序(又称扩增子测序)是利用二/三代测序平台,对16S rDNA/18S rDNA/ITS/功能基因等特定区段PCR产物进行高通量测序,突破传统微生物不可培养的缺点,获得环境样本中的微生物群落结构、进化关系以及微生物与环境相关性等信息。适用范围医学领域:常见疾病与人体微生物的关系动物领域:瘤胃产甲烷菌类群研究等农业领域:农业耕作等环境领域:雾霾处理、污水治理、石油降解、酸性矿水处理等特殊极端环境:气候变化导致的环境变化研究实验流程::分析流程技术参数样本类型土壤:10 g;粪便:3-5 g;血液:10   mL;污泥:5-10 g;  DNA:总量 ≥ 4 μg、浓度 ≥ 50 ng/μL、1.8 < OD260/280 < 2.0平台选择Illumina   PE250/300、PacBio平台推荐测序量土壤:2-3万;粪便:2-3万;肠粘膜:1-2万;胃液:1-2万;  水样:>1万;沉积物:>1万;皮肤表面:1-2万2. DNA常规测序测序特色a.  取样快高效快捷的专业物流,每天两次取样,保证样品第一时间到达实验室。b.  瑞金特生物测序单序列读长可达800~900bp。c.  瑞金特生物提供的可靠碱基,质量值均在Q20以上。d.  操作精专业的技术人员,严格SOP双重质控,样品数据真实可靠。e.  效率高质粒和已纯化PCR产物,24h出结果,菌和未纯化PCR 产物,36~40h出结果。a.  不怕难瑞金特生物结合自主研发的试剂及BI dGTP BigDye terminator v3.0等昂贵试剂,能有效解决高GC、发夹结构等难题。免费服务根据不同的需求,我们还可以为合作伙伴免费提供:a.  测序引物设计和评估b.  序列拼接c.  DNA序列的基本分析d.   Primer Walking引物设计e.   菌液活化3. EST测序EST(Expressed Sequence Tag)表达序列标签是指随机从构建的cDNA文库中挑选克隆,并进行5'端和3'端一次性测序所获得的短cDNA部分序列,一般长度为150~500bp。虽然EST只是完整基因的一部分,但是其序列长度已足以代表该基因,因此可以采用EST特异性地标记基因。目前,EST的数目比GenBank中其他核苷酸序列多,所以在EST 库中更容易搜寻到新的基因,它已被广泛地应用于基因的识别。另外,由于EST 来源于特定组织在特定环境下总mRNA所构建的cDNA文库,因此EST也能说明该组织中各基因的表达水平。EST测序的应用a.  基因表达谱分析b.  SSR标记的发掘c.  作为构建分子标记连锁图谱的探针生物信息分析1. 基本信息分析a.从峰图到序列的转化,去除低质量的序列和载体序列b.序列拼接c. EST注释d. ORF预测及分析e. 基因注释(NR、NT数据库)2. 高级信息分析a.功能蛋白分析b.Interpro功能域分析c.序列属性及其对应Unigene的分析d. COG分析e. Pathway分析提供结果 1. 测序峰图及序列文件 2. 生物信息分析报告4.小基因组Shotgun测序鸟枪战略(Shotgun Strategy)又称随机测序战略,是由美国塞莱拉遗传公司创始人克雷格·文特尔发明,主要针对大片段的全长测序。此策略是将基因组DNA用机械方法随机打断成小片段,并连入合适的载体构建亚克隆文库,从中随机挑取克隆测序,再通过生物信息学方法对测得的序列进行拼接组装以获得大片段DNA的序列。构建不同插入片段大小的Shotgun文库(1.5~3 Kb、4~6 Kb、6~8 Kb等),可减少因基因组中的重复序列造成的错误拼装,提供更多Contigs之间的关联信息。Shotgun策略已广泛应用于包括基因组、叶绿体、线粒体、野生质粒、噬菌体、病毒以及Fosmid/Cosmid/BAC克隆等的全长测序。优势a.  成熟的Shotgun文库构建体系,确保您在最短时间拿到数据我们曾创造了10个工作日完成40 Kb Fosmid全长测序的记录。b.  专业的生物信息团队:能提供可靠精准的序列拼接结果,8~10倍覆盖率,phred-20质量标准,全长准确率大于99.99%,并可提供专业的生物信息分析。c.  丰富的实战经验:目前已成功完成了包括链霉菌、水稻、番茄、扬子鳄、熊猫、朱鹮等物种的Fosmid/BAC克隆全长测序1000余例,小鼠、蚯蚓、油菜花、大豆等物种的线粒体100余例,大肠杆菌的野生质粒、噬菌体、病毒等全长测序20余例。我们所提供的全长序列已被众多实验室用于发表学术论文。提供结果完整的实验报告(包含实验细节、质控点、数据拼接记录和完整序列)。收费标准5.BAC末端测序细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)文库的构建是进行基因组研究的一项重要基础性工作,特别是对大基因组及超大基因组生物来说更是如此,在物理作图、基因图位克隆、基因结构和调控等研究中发挥了重要作用。BAC末端测序技术通过测定插入片段两端的序列,能够迅速而精确地进行序列拼装,并确定基因组序列结构的多态性,如倒置和易位等,在基因组全序列测序中有着举足轻重的作用。  BAC末端测序难点  一般来说,BAC测序比质粒或PCR产物的测序要困难得多。主要难点体现在以下几个方面:a.  BAC质粒插入片段长(一般大于100 Kb),容易形成二级结构,而二级结构区域后的DNA链可能会因延伸不够充分而造成测序异常。b.  BAC测序需要毫克级高纯度的DNA,从而获得充足信号,以利于准确的碱基信号检出和最大读长的获得。但是BAC质粒在细菌中为单拷贝或低拷贝,DNA提取和纯化难度很大。c.  测序反应完成后,产物需进行纯化才能上机(ABI3730xl)检测。常规的纯化方法不能够完全去除残留的荧光染料,这会导致序列彩图中出现严重的干扰峰。优势a.  DNA提取环节:利用自主研发的BAC克隆DNA提取试剂和独特的提取方法,瑞金特生物可以利用96孔深孔板进行BAC克隆的培养和批量化DNA提取,获得的BAC DNA的质量和纯度完全满足测序需求。b.  测序反应环节:对测序反应体系进行了优化,在反应体系中添加了以MgCl2为主要成分的自制缓冲液,增加了BigDye中Taq酶的活性,从而极大提高了测序的质量和成功率。c.  测序反应纯化环节:采用BigDye XTerminator纯化试剂盒,可稳定地去除BAC末端测序中的染料污染,从而消除了干扰峰的出现,并且能够显著增强测序数据的信号强度。

实验原理DNA甲基化存在于大多数真核生物中,一般发生在CpG双核苷酸中胞嘧啶的5’UTR区,起调控作用。CpG的胞嘧啶大概有80%被甲基化,20%处于基因调控区的CpG岛中。BSP甲基化测序(Bisulfite Genomic Sequencing PCR)的原理通过对基因组DNA进行重亚硫酸盐处理,非甲基化的胞嘧啶被脱氨基而转变成尿嘧啶,在随后的PCR反应中尿嘧啶转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不能被脱氨基,在反应完成时被保留,我们将扩增得到的PCR产物进行TA克隆测序,就可以分析甲基化发生的具体情况。该方法实验结果准确性高,是甲基化检测的金标准。实验流程

实验原理继植物中发现基因沉默现象后,动物细胞中的双链RNA诱导的基因沉默现象也被阐明,并于2006年获得诺贝尔医学奖的肯定,足以说明RNAi技术在医学领域即将发挥的开创性作用。siRNA(Small interfering RNA)是21-25核苷酸的小分子RNA,由Dicer酶加工双链RNA而成。siRNA与体内多种酶类结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC),从而激发与之互补的目标mRNA的降解。天然的RNAi现象存在于包括人类在内的动植物体内,在调节基因表达和预防病毒感染方面起到重要作用。实验流程

实验原理继植物中发现基因沉默现象后,动物细胞中的双链RNA诱导的基因沉默现象也被阐明,并于2006年获得诺贝尔医学奖的肯定,足以说明RNAi技术在医学领域即将发挥的开创性作用。siRNA(Small interfering RNA)是21-25核苷酸的小分子RNA,由Dicer酶加工双链RNA而成。siRNA与体内多种酶类结合形成RNA诱导的沉默复合物(RISC),从而激发与之互补的目标mRNA的降解。天然的RNAi现象存在于包括人类在内的动植物体内,在调节基因表达和预防病毒感染方面起到重要作用。实验流程

实验原理miRNA是在真核生物中发现的具有调控功能的内源性非编码RNA,大小约20~25个核苷酸。我们根据成熟miRNA序列信息,合成含有茎环结构的前体miRNA连接至含侧翼序列的表达载体中,将其转染/病毒包装感染进入细胞后,由II型启动子(CMV)启动表达,经核酸酶的剪切加工,组装RNA诱导的沉默复合体,通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。实验流程

实验原理通过qPCR准确进行miRNA在细胞或组织样本中的表达分析是研究miRNA功能的基础。将小片段的miRNA通过聚合酶A加尾,再通过含有通用序列的Oligo序列进行反转录,合成特异性的miRNA引物及通用引物即可对miRNA进行qPCR检测工作。实验流程

实验原理miRNA通过碱基配对结合到靶mRNA的3’UTR区,抑制靶基因的翻译或对靶基因mRNA的降解达到调控基因表达的目的。将靶mRNA的3’UTR区构建至萤火虫荧光素酶报告基因的3’端,与miRNA表达载体及海肾荧光素酶报告基因载体共转染细胞,先后加入两种底物荧光素,通过对荧光素酶报告基因的表达检测确认miRNA对靶基因的调控效果。实验流程

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