B16小鼠黑色素瘤人工肺移植模型【实验原理】 B16是C57BL/6小鼠耳根部皮肤上发现的自发性黑色素瘤,以后又在该瘤株中筛选出肺部高转移的集落株,小鼠静脉内移植后主要形成肺转移瘤,肺外转移极少。该瘤细胞注入静脉内,在短时间内直接把大量瘤细胞输入血液循环,不经过癌转移的前几个过程,故称为“人工转移”模型,以区别于“自发性转移”模型。该模型体现了肿瘤细胞进入血液循环后癌转移的几个步骤,对于研究肿瘤细胞在循环系统中的生成能力,瘤细胞附着、穿越靶器官血管的能力和探讨癌转移的器官特异性则有其独特的优势。【操作步骤】 取体外对数生长期的B16小鼠黑色素瘤细胞,经胰酶消化,以磷酸缓冲液配置成瘤细胞悬液,浓度为2.5*105/ml,,相应宿主尾静脉接种0.2ml/只。随机分组进行实验,3周后以颈椎脱臼法处死小鼠,称小鼠体重,剖取肺,称肺重,用解剖显微镜计数各肺叶的转移集落数,转移集落成黑色或灰黑色,相互间不融合。【结果计算】 计算给药组平均肺集落数与阴性对照组的平均肺集落数,计算肺转移抑制率。实验热线：19931682702（同微信）

(1)复制方法体重为21～25g的BALB/c小鼠(也可用体重为200g左右的大鼠),雌雄不限。动物适应性饲养1周,实验前禁食12h。腹腔注射麻醉后,将动物仰卧固定于手术板上,腹部手术区常规消毒与去毛,无菌条件下用手术刀在腹壁作一长约2cm切口,经切口进腹在回盲瓣远端分离并以3号丝线结扎盲肠,用18号注射针头于结扎端穿孔2次,并挤出粪便少许,然后用4号丝线间断缝合腹膜及皮肤,同时立即皮下注射生理盐水50ml/kg体重抗休克。(2)模型特点造模后小鼠逐渐出现竖毛、腹泻、脓尿,模型动物表现出饮水、进食及活动次数减少,动物常于术后12h全身炎性反应达峰值,小鼠活动次数明显减少,且活动失去昼夜规律。应用动物进行盲肠结扎穿孔是复制临床脓毒症模型,尤其是胃肠穿孔的最佳动物模型,它能很好地反映出脓毒血症发展过程中免疫学及血流动力学的双向变化。(3)比较医学脓毒血症是机体神经、免疫、内分泌、凝血等系统功能严重受损后,其中各种有害性刺激(主要是外源性微生物)可激活机体免疫细胞,导致大量促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子a(TNFa)、白细胞介素6(IL6)、生物活性介质,如一氧化氮(NO)、反应性氧自由基(O-2)生成和释放,进而引起炎症的瀑布样级联反应,在全身炎性反应的进行性加重方面起关键作用。目前在脓毒血症的研究已达分子水平,临床上治疗手段也日趋完善,但脓毒血症、脓毒血症休克、多器官功能不全乃至最终多器官功能衰竭,仍是外科危重患者死亡的主要原因。因此,包括用本方法在内建立的腹腔感染动物模型,以及用其他方法复制的多器官功能不全动物模型、多器官功能衰竭动物模型与人类相关疾病在疾病的某些特征方面仍有许多相似之处,有较大的研究应用价值。实验热线：19931682702

帕金森病(PD)是一种发生于人类中老年中枢神经系统的疾病,动物并不自然发生该病。给动物使用不同的神经毒素如6-羟基多已胺。甲基安非他明、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢砒啶(MPTP)以及Fe2可模拟出该病的某些特征。PD的运动症状和相应的病理变化可在动物如小鼠、大鼠、灵长类等观察到,大量的研究表明,中脑双侧苍白球和黑质DA能神经元坏死是PD的主要病理学改变。1.操作步骤Wistar大鼠,雌雄均可,体重200-250g。腹腔注射麻醉。约5分钟动物麻醉平稳后,将动物俯卧位固定于小动物立体定位仪上。上耳杆时注意对称和稳固,上牙齿固定于门齿棒上,并用压杆压往鼻骨。剪去头部顶毛,切开或剪开皮肤,范围为:两外耳道中线连线前后各0.5厘米。用眼科剪去除颅骨表面的结缔组织膜或用手术刀刮去,以使颅骨表面尽可能干净。少量出血时用于棉球压迫止血。稍候干燥,可见到颅骨表面呈白色,前囟、后囟清晰可见。将注射用的10ul或25ul Hamilton微量注射器固定于立体定位注射仪上颅骨正上方,准备好牙科钻头,钻头直径0.8m1。损毁部位为单侧黑质或内侧前脑束。以前囟为标准参考点,进针点可选择左侧或右侧。有时前囟不清晰,可分别按压两侧的顶盖骨和额骨,在“按压一放松”的过程中,便可清晰见到前囟。依Paxson《The Rat Brain》图谱,注射部位的坐标为:第一点(mfb),门齿棒高于耳杆3.4mm。前囟后4.0mn1,中线左旁开0.8mm,颅骨表面下8.0mm:第二点(SNC),门齿棒低子耳杆2.3mm,前囟后4.l4mm,中线左旁开1.2mm,颅骨表面下7.8mm。用牙科钻钻开颅骨恰至软脑膜表面。用小号针头轻轻挑破软脑膜。此时注意最好不要用钻头直接钻破软脑膜,以免大量出血。每点注射6-OHDA溶液4ul(12ug),注射速度为lul/min,留针10分钟,缝合皮肤,将术后的大鼠置于安静保温处直至清醒,自由进食饮水。2.模型检测行为学检测:依照国际通用的标准(Hudson等,1993),对注射过6-OHDA的大鼠,于术后第二周开始筛选。即每周一次腹腔注射APO(0.25mg/kg体重)诱导其向健侧旋转,共筛选3周,每次记录30分钟,旋转210圈以上者为PD大鼠。病理学检查:模型成功的动物,过量麻醉,开胸,经心脏从胸主动脉滴入(或经恒流泵输入)0.1mol/L的磷酸缓冲液(pH7.3-7.4))或l%的多聚甲醛(磷酸缓冲液配制)100-150m1,然后继续输入4%多聚甲醛(磷酸缓冲液配制)200ml以进行内固定。全脑取出后,继续在4%多聚甲醛溶液中浸泡24小时以上进行外固定。然后经30%蔗糖置换后,OCT包埋,快速冰冻切片,片厚10um。常规病理学检查,或进行酪氨酸羟化酶(tyrosine droxylase,TH)的免疫组化染色,观察DA神经元的数目。可见损伤侧黑质致密部DA神经元明显缺失,胶质细胞增生,残留神经细胞固缩,部分胞浆明显肿胀和空泡变。同侧纹状体内DA神经元末梢的TH反应性大为降低甚至消失。生理盐水对照组上述部位DA神经元与未受损侧相比,无显著差别。尾核、豆状核可无明显特异性改变。生化检查:动物迅速断头取脑,速冻至-70℃。采用立体定位方法穿刺得到损伤侧与未损伤侧纹状体组织标本(湿重大约0.3mg)。高效液相电化学法(HPLC-ECD)检测中脑黑质、纹状体DA、高香草酸(HVA)和3,4-DOPAC的含量。可见受损侧上述部位的DA、HVA、DOPAC含量均降低。实验数据统计分析方法:旋转行为及DA等含量测定结果采用配对,检验。实验热线：19931682702（同微信）

简介:梅尼埃病(Ménières disease)是一种特发性内耳疾病,该病主要的病理改变为膜迷路积水,临床表现为反复发作的旋转性眩晕、波动性听力下降、耳鸣和耳闷胀感。已知的病因包括以下因素:各种感染因素(细菌、病毒等)、损伤(包括机械性损伤或声损伤)、耳硬化症、梅毒、遗传因素、过敏、肿瘤、白血病及自身免疫病等。豚鼠自身免疫免疫性梅尼埃病模型采用同种内耳抗原免疫豚鼠,部分动物能够对同种内耳抗原产生免疫应答,导致了单侧或双侧听力受损,并出现眼震等梅尼埃病症状。 模型制作方法:豚鼠,体重350g-400g,雌雄兼用。抗原制备 同种内耳抗原(GPCAG)取自豚鼠新鲜期骨。处死豚鼠后立即在解剖显微镜下取出迷路组织,置放与4℃0.01mol/l PH7.2的PBS中捣碎,匀浆,2500r/min离心10min,取上清液在751紫外分光光度计测定蛋白的含量,将蛋白浓度调到1200ug/ml。制成后立即免疫动物或加1/10000NaN3低温保存。豚鼠免疫方法 以同种内抗原400ug/0.05ml+CFA0.5ML,于豚鼠后足及背部皮下注射,第14天重复注射1次;第28天GPCAG 400ug/0.5ml+CFA0.5ml,于豚鼠背部多点皮下注射,第42天重复第28天注射1次。免疫后第9周检测动物模型是否成功。观测指标与分析: (1)、白细胞移动抑制试验;(2)、血清抗特异性内耳抗体;(3)循环免疫复合物;(4)、耳蜗电图测试耳蜗微音电位和AP;(5)内耳石蜡切片;(6)、内耳酶免疫组化学。如实验动物出现符合四个条件,即判断为动物模型成功。实验热线：19931682702

模型制作方法： SD大鼠，体重165g-250g，雌雄兼用。（1）分组 根据皮层体感诱发电位（CSEP）P1-N1波幅变化随机分组。A组：空白对照；B组：脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅下降术前波幅30%(结果表明脊髓损伤不明显）；C组：脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅下降术前波幅50%；D组：脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅下降术前波幅70%.（2）动物模型制作 以5%水合氯醛（6ml/kg）腹腔内注射麻醉大鼠，动物置于25-30℃温度下，腰背部脱毛，俯卧位固定，在放大镜下以T13-L3棘突及椎板，用血管钳咬除T13-L2棘突、椎板、黄韧带等。暴露T13-L2相应部位脊髓并保持脊髓完整，将脊髓撑开器固定在T12-L2椎体横突上，纵向牵张，每10s内撑开1mm，间歇5min至实验室要求的波幅后持续10min。即B、C、D三个模型组脊柱撑开致CSEP的P1-N1波幅分别下降术前波幅的30%、50%、70%。 观测指标与分析：（1）皮层体感诱发电位监测；（2）神经功能检测；（3）脊髓病理学检查。实验热线：19931682702

铝诱导痴呆模型是以阿尔茨海默型痴呆的铝中毒假说为基础的。铝具有神经毒性,据报道,阿尔茨海默型痴呆者脑组织内铝的含量明显比正常人高,其原因可能是病人血液中铁蛋白有缺陷,无法将血液中的铝适当的清除,多余的铝进入大脑后参与形成神经元纤维缠结和老年斑,损伤神经元,导致神经元纤维变性,大脑皮质萎缩。模型制作方法: Wistar大鼠,雄性,体重200-220g。大鼠每天灌胃三氯化铝500mg/kg,连续30天。观测指标与分析 : 海马内淀粉样前提蛋白阳性神经元数量计数:与正常组相比,模型组大鼠背海马和齿状回内前提蛋白阳性神经元明显增加。实验专线：19931682702（同微信）

偏头痛表现为发作性的偏侧搏动性头痛,伴恶心及呕吐等,经一段歇期后再次发病。在安静、黑暗环境内或睡眠后头痛缓解。在头痛发生前或发作时可伴有神经、精神功能障碍。颅内存在头疼敏感组织如大的脑血管、硬脑膜、软脑膜血管、静脉窦,其血管周围的神经纤维源自三叉神经节,当供应硬脑膜及脑血管壁上的三叉神经纤维末梢受到电刺激时,血管活性肽类物质可以被释放出来,其具有强烈的扩张血管及致头痛作用可诱发神经源性炎症。模型制作方法:SD大鼠,体重250-280g,雄性。参照Csillik的方法,大鼠腹腔注射麻醉后,固定在鼠脑定位仪上。头顶正中切口,充分暴露前颅,于前颅后3.2-3.4mm,旁开2.8-3.2mm处,用0.8mm的牙科钻打孔,然后将电极插入三叉神经节。调试刺激电极,电刺激参数为方形脉冲5Hz,电流强度0.5-1mA,持续时间10min。观测指标与分析:(1)行为学观察;(2)血浆神经降压素和心钠素含量测定。实验专线：19931682702（同微信）

研究某个基因的功能最常用的手段是在宿主细胞中过量表达或者通过RNA干扰的方法knock-down该基因,常规手段有瞬时转染和筛选稳定细胞系。筛选出该基因的过表达或者RNA干扰的稳定细胞系会给您的实验带来极大的便利。有了稳定细胞系,后期的Co-IP或者Pull-Down实验会非常便利;稳定表达重组荧光蛋白的细胞系可以让您动态的观察分子在细胞中的运动。 构建稳定细胞系的基本原理是将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上,载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中,用载体中所含的抗性标志进行筛选。最常用的真核表达载体的抗性筛选标志物有新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)和嘌呤霉素(puromycin),常用G418来代替新霉素进行选择性筛选,筛选得到可稳定表达目的蛋白,或者稳定表达沉默特定基因的细胞株。筛选稳定细胞系的方法1)转染质粒后,单克隆方法筛选稳定细胞系2)慢病毒感染筛选稳定细胞系慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效,是目前主流的稳定细胞系筛选方法。慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达,因此,慢病毒常用于制备稳定表达/沉默特定基因的单克隆细胞株。实验专线：19931682702（同微信）

比格犬是最常用的实验用犬，已成为实验研究型中最标准的动物，在国外，它已被广泛用于生物化学、微生物学、病理学、病毒学、药理学以及肿瘤学(如癌的病因学和癌的治疗学等)等基础医学的研究工作中，而农药的各种安全性试验，特别是农药工业中的各种实验，使用该犬最多。性情温和，易于驯服和抓捕，亲人。遗传性能稳定，在研究工作中为了得到重复性好而稳定，Beagle 品种固定且优良，一般无遗传性神经疾患。反应的一致性，形态体质均一，由于它血液循环系统很发达，且器官功能也是一致的，表现在体温稳定，又比杂种犬体温低0.5C，因此在实验中反应一致性好，尤其在实验中对环境的适应力、抗病力较强。性成熟期早，约8~12个月，产仔数多。由于该犬性格温顺，容易调教，遗传性疾病少，实验重复性好，尤其适合药理、循环生理、眼科、毒理、外科学等的研究，被国际医学、生物学界公认为较理想的实验用犬。实验专线：19931682702（同微信）

原理凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异),和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。EMSA实验步骤1.探针的标记2.探针的纯化3.EMSA 胶的配制4.EMSA结合反应5.电泳分析需知方法: 同位素P32标记探针/生物素/荧光素标记/进行检测。技术要点实验过程包括核蛋白的提取,同位素标记/生物素/荧光素标记/与纯化,凝胶电泳,胶片暴光等。在EMSA操作中会用到同位素,要注意实验室环境和实验员的保护。整体课题实验外包：19931682702（同微信）