实验流程1、基因优化:靶基因序列设计,密码子优化并合成目的基因。2、载体-宿主系统优化:根据蛋白特性构建表达载体,转化质粒到高效表达的大肠杆菌中。3、表达条件优化:对重组的大肠杆菌进行摇瓶培养,并通过SDS-PAGE电泳检测对表达条件(时间、温度、IPTG浓度)进行严格控制和优化。4、纯化蛋白:对表达的蛋白采用亲和,离子或凝胶过滤层析等方法进行纯化。首选上清,次选蛋白复性。对实验用SDS-PAGE和Western Blot验证目标蛋白纯度正确性,按照客户要求进行分装或冻干。须知1、无污染的质粒,最小量不得低于100ng2、原始质粒图谱及序列文件3、插入基因后质粒的商业测序报告4、目标蛋白质相关信息5、最终蛋白一般保存在常规的缓冲液中(Tris-HCl,PBS)实验热线：19931682702（同微信）

模型制作方法: SD大鼠,7日龄,体重11-17g。新生大鼠清醒局部麻醉状态下,行右侧颈总动脉结扎术,再将动物置于恒温密闭玻璃容器中,通以8%O2+92%N2的混合气体,2h后取出,造成幼鼠窒息脑瘫模型。 观察指标与分析: 症状观察; 头部血流量测定; 脑组织水含量测定; 脑组织中NO含量测定; 脑组织中丙二醛含量测定。实验专线：19931682702（同微信）

模型制作方法:SD大鼠,7日龄,体重12-16g,雌雄兼用。模型组动物麻醉,结扎左侧颈总动脉,缝合切口,放回原饲养环境中回复2小时,置动物于2000ml密闭容器中,通入含有8%氧气的混合气体,流量为3l/min。2小时后恢复正常供氧。制成左侧大脑半球缺氧动物模型。观测指标与分析:(1)脑组织病理学检查;(2)脑组织细胞凋亡检测;(3)脑组织缺氧诱导因子(HIF)-1amRNA表达水平检测;(4)脑组织半胱天冬酶表达水平的检测;(5)脑组织碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达的检测;(6)脑神经干细胞的检测;(7)脑组织胶原纤维酸性蛋白检测;(8)脑组织c-fos基因表达水平;(9)学习、记忆功能检查;(10)脑组织单胺类神经递质含量测定;(11)脑组织MDA和SOD水平测定;(12)脑纹状体组织Par-4蛋白表达水平检测;(13)脑组织钙离子含量测定;(14)热休克蛋白70表达水平检测;(15)脑组织白介素-1β含量测定;(16)脑组织一氧化氮含量测定。实验专线：19931682702（同微信）

近年来为建立一种逐渐发生发展的心肌梗塞模型,较为广泛地使用了一种遇水膨胀的纤维素环(Ameriod),这种纤维素环套在预期闭塞的冠状动脉上,环外边以金属圈(如不锈钢)固定起来,手术后两周或更长的时间内可将冠状动脉逐渐闭塞。这种模型制造较易,动物生存率高。但即是使用这样的方法,仍然缺乏人类的动脉粥样硬化的病理学基础。近来有报告指出,家猪可以喂饲高脂饮食形成冠状动脉的粥样硬化,引起心肌缺血,又可以通过改变饮食或治疗使动脉粥样硬化的斑块消退。看来,这是值得注意探索的目标。国内有关心肌缺血和心肌梗塞模型的复制方法:1.电刺激法 是近年建立的一种造成动物实验性心肌缺血的较新方法。实验一般用成年雄性家兔,麻醉后用定向仪插入两支涂绝缘漆的不锈钢针,以弱、强刺激(弱刺激为0.8～1.6mA,强刺激为4～8mA)交替刺激右侧下丘脑背内侧核,每次刺激5分钟,间隔1～3分钟。2.药物法 亦为近年来采用的一种方法。最常使用的造型药物为4%异丙基肾上腺素,给大鼠皮下注射50mg/kg体重;或将药物加入500ml盐水中从家兔耳静脉匀速(4小时)滴入,每公斤体重可分别给药10、20、30mg,或直接将药物注入腹腔均可造型。也可用麻醉犬静脉给予麦角新硷0.2mg/kg 体重,造成冠状动脉痉挛。3.冠脉阻断法 结扎冠状动脉是制作心肌梗塞模型的最常用方法。一般选用成年健康犬或家兔,麻醉后开胸,多结扎其冠状动脉前降支阻断心肌供血,引起病变;也有人采用闭胸式选择性冠状动脉插管法,即在荧光屏下将心导管由麻醉犬的颈动脉切口处插入,沿主动脉壁直抵左窦底部,将其尖端送至左冠状动脉内约2cm深处,向导管内注入120mg/kg体重的汞,形成急性心肌梗塞。亦有人用冠状动脉周围套线牵拉法使其不完全阻断,以形成家兔急性缺血性濒危心肌模型。为了更接近自然状态下心肌缺血的变化,近来有的单位用清醒犬作急性缺血和梗塞模型。先将犬麻醉,然后分离冠状动脉长约10毫米,套上冠状动脉压迫环,用注水压迫阻断冠状血流,观察犬在清醒状态下的心肌缺血反应与药物效应。此外,还有用离体大鼠心脏冠脉结扎复制出超微结构的心肌缺氧损伤模型。实验热线：19931682702（同微信）

糖尿病(DM)及其并发症不仅严重影响糖尿病患者的生活质量,同时也是致残、致死的重要原因。因此,建立合适的糖尿病动物模型,阐明DM及其并发症的发病机制就显得尤为重要。目前,DM动物模型制备方法主要有:手术切除胰腺、化学药物诱导、自发性糖尿病动物模型等。一、切除胰腺的DM模型常采用大鼠造模,全部或大部分切除实验动物的胰腺,但保存胰十二指肠动脉吻合弓。如果连续两天血糖值超过11.1mmol/L或者葡萄糖耐量试验120min时的血糖值仍未恢复到注射前水平则认为DM造模成功。其机制是全部或大部分切除胰腺后,β细胞缺失而产生永久性DM。二、化学药物诱发的DM模型采用链脲佐菌素腹腔注射或四氧嘧啶静脉注射可诱发DM,常用动物有小鼠、大鼠、家兔和犬。链脲佐菌素(streptozotocin STZ)的参考剂量为50～150mg/kg;四氧嘧啶(alloxan)的参考剂量为60～110mg/kg。STZ是一种含亚硝基的化合物,进入体内可通过以下机制特异性地破坏胰岛β细胞:(1)STZ直接破坏胰岛β细胞:主要见于注射大剂量STZ后。STZ注射后可引起β细胞内辅酶I(NAD)的浓度下降,NAD依赖性能量和蛋白质代谢停止,导致β细胞死亡;(2)通过诱导一氧化氮(NO)的合成,破坏胰岛β细胞;(3)STZ激活自身免疫过程,进一步导致β细胞的损害:小剂量注射STZ可破坏少量胰岛β细胞,死亡的胰岛β细胞可作为抗原被巨噬细胞吞噬,产生TH1刺激因子,使TH1细胞系占优势而产生IL-2及IFN-γ,在胰岛局部促使炎性细胞浸润,并活化释放IL-1、TNF-α、IFN-γ、NO和H2O2等物质杀伤细胞。死亡细胞又可作为自身抗原,再次递呈给抗原递呈细胞进行处理,释放细胞因子,放大细胞损伤效应,最终诱发DM。四氧嘧啶进入体内后能迅速被胰岛β细胞摄取,影响细胞膜的通透性和细胞内ATP的产生,抑制葡萄糖介导的胰岛素分泌。四氧嘧啶主要通过产生氧自由基破坏β细胞结构,导致细胞的损伤及坏死,从而阻碍胰岛素的分泌,使血清胰岛素水平降低。因为四氧嘧啶导致糖尿病的同时也造成肝、肾组织中毒性损害并且部分采用四氧嘧啶制造的DM动物模型可自发缓解,因此目前已经很少应用。三、自发性糖尿病动物模型该模型绝大多数采用有自发性DM倾向的近交系纯种动物,如BB(Biobreeding)鼠、NOD(non-obesity diabetes)小鼠、G(Goto-kakisaki)鼠和中国地鼠(chinese hamster)等动物造模。自发性DM动物模型是指动物未经过任何有意识的人工处置,在自然情况下发生DM的动物模型。已用于研究的自发性DM动物约有20种,可分为两类:一类为缺乏胰岛素,起病快、症状明显,并伴有酮症酸中毒,如BB(Biobreeding)鼠、NOD(non-obesity diabetes)小鼠和LETL大鼠,它们可以作为1型DM的动物模型使用。这些动物没有肥胖,发病之初呈现胰腺炎的症状,人类组织相关性抗原(MHC)参与发病过程,这些都与人1型DM的特征相似。利用这些模型可以对人1型DM的发病机制进行深入研究;另一类为胰岛素抵抗性高血糖症,其特点是病程长,不发生酮症酸中毒,为2型DM动物模型。实验热线：19931682702

染色质免疫沉淀技术的原理是:在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。常见问题:1.ChIP是什么?答:染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,简称ChIP)是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性,可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。2.ChIP有哪些应用?答:近年来由于该技术不断的发展和完善,其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用,发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用;从研究一个目的蛋白与DNA的相互作用,发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用;从研究启动子区域的组蛋白的修饰,发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。3.ChIP技术的原理?答:生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,通过超声或酶处理将染色质切为小片段后,利用抗原抗体的特异性识别反应,将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定,染色质断裂,染色质免疫沉淀,交联反应的逆转,DNA的纯化,以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多,结果的重复性较低,所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照,而且对结果的分析也需要有一定的经验。4.做ChIP试验,必须做甲醛固定么?答:不一定,视样品及试验方案而定。做甲醛固定的为X-ChIP,而不需要固定的为N-ChIP。甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质,蛋白质-DNA,蛋白质-RNA交联,形成生物复合体,防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的,便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。5.为什么必须将DNA切碎至少于1000bp大小(大约3个核小体 ~400-500bp)?答:为确保ChIP实验有良好精度。若您的平均片段长度大于1000bp,您将会分离获得包含您目标序列的DNA,但所要研究的蛋白会离您目标序列有700个核苷酸的距离。6.为什么使用鲑鱼精子DNA来封闭琼脂糖珠子?为什么我的样品中鲑鱼精子DNA不会发生PCR反应?答:鲑鱼精子用于降低降低染色质DNA与琼脂糖珠子的非特异性结合。实验者不太可能对鲑鱼组织做ChIP实验,所以此DNA不会因交叉杂交而被PCR引物扩增。7.引物最佳设计是什么样的?答:引物长度应为24个核苷酸,应含有50%GC碱基对,Tm值为60°C。不要扩增大于600-800个核苷酸的序列。不必考虑基因组内不独一序列。8.您推荐下如何从琼脂糖(或琼脂糖凝胶)中洗脱抗体-蛋白-DNA复合物,用来做re-ChIP试验?答:在ChIP分析试剂盒内可找到洗脱缓冲液,用它洗脱复合物。对于re-ChIP,有必要添加蛋白酶抑制剂到免疫沉淀洗液和洗脱缓冲液,及第二轮实验用的稀释缓冲液。请确定所有溶液处于低温,蛋白质不会因此而在收集第一次免疫沉淀的复合物或第二次免疫沉淀时降解。9.蛋白A琼脂糖能被用于小鼠IgM?答: 蛋白质A不能与小鼠IgM结合。可以考虑用一个桥接抗体连接。10.在做ChIP之前,有办法纯化细胞核么?答: 在细胞与甲醛交联后,细胞核可通过“溶胀缓冲液”培育及剪刀细胞均质器(dounce homogenization)制备(至少10倍体积)。   溶胀缓冲液:   25M Hepes, pH 7.8   1.5mM MgCl2   10mM KCl   0.1% NP-40   1mM DTT   0.5mM PMSF   蛋白酶抑制剂混合剂   然后按照protocol在SDS裂解液中裂解11.ChIP超声波的最佳条件?答: 1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。   2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。   3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。   4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。   5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。   6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。12.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:13.ChIP超声波的最佳条件?答: 1. 确定裂解物在冰上放置了至少10分钟。不要震荡或者摇晃裂解物,避免有气饱(气泡产生)。超声波仪会替你做这些。   2.脉冲应在~10秒(与体积一致)。   3. 样品量小于400 uL间隔应大于1分钟,在EP管中的更大体积间隔大于3分钟。   4. 避免泡沫。请确定超声探头靠近液体底部(不能让探头碰到管壁)。   5.若发现泡沫,立即停止超声,置于冰上。旋转EP管以去除泡沫,继续超声。   6. 在按“开始”键之前将探头置于液体中。14.客户能只用哺乳动物细胞的细胞核而不是整个细胞么?答: 是,实际上比起全细胞,细胞核更好。我们用全细胞裂解物,因为它更简便,通常也能得到好结果。此页有一些相关信息:15.什么是input DNA? Output DNA?从染色质上获得的未做过IP的已经被逆转交联的DNA. 它是检查PCR是否有效的对照。Output DNA是来自每次IP实验的DNA.其实就是genomic DNA. 在ChIP实验中, sonication 或酶解后, 样本取部分不做IP, 直接逆转交联. 它的最主要的作用就是检查PCR系统是否work. 通常情况下, 在该条道中,都可以看到条带的.如果没有,说明PCR系统不work.16.为什么ChIP试验需要用经验证的抗体?抗原抗体之间的结合是通过抗体特异性的识别抗原表位并结合的,有的抗体识别的抗原表位比较小,不容易暴露,在ChIP实验中容易被DNA包裹,从而使抗体无法结合,因此用来做ChIP的抗体一般是需要经过chip实验验证的,商业化的抗体都应该是验证过的。17.什么是reChIP技术?ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联,而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀,从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。值得注意的是,因为 通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少,所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作

模型制作方法:SD大鼠,7日龄,体重12-16g,雌雄兼用。模型组动物麻醉,结扎左侧颈总动脉,缝合切口,放回原饲养环境中回复2小时,置动物于2000ml密闭容器中,通入含有8%氧气的混合气体,流量为3l/min。2小时后恢复正常供氧。制成左侧大脑半球缺氧动物模型。观测指标与分析:(1)脑组织病理学检查;(2)脑组织细胞凋亡检测;(3)闹组织缺氧诱导因子(HIF)-1amRNA表达水平检测;(4)脑组织半胱天冬酶表达水平的检测;(5)脑组织碱性成纤维细胞生长因子mRNA表达的检测;(6)脑神经干细胞的检测;(7)脑组织胶原纤维酸性蛋白检测;(8)脑组织c-fos基因表达水平;(9)学习、记忆功能检查;(10)脑组织单胺类神经递质含量测定;(11)脑组织MDA和SOD水平测定;(12)脑纹状体组织Par-4蛋白表达水平检测;(13)脑组织钙离子含量测定;(14)热休克蛋白70表达水平检测;(15)脑组织白介素-1β含量测定;(16)脑组织一氧化氮含量测定。实验热线：19931682702（同微信）

肿瘤细胞皮下接种成瘤模型操作流程: 1. 挑选合适成瘤的细胞进行培养; 2. 按照一定的细胞量(1×106-107cells)注射裸鼠; 3. 饲养裸鼠至肉眼可见瘤体; 4. 测量瘤体大小(长径,短径,连续2-4周,2-3天一次); 5. 裸鼠拍照、摘取瘤体,进行后续处理。

B16小鼠黑色素瘤人工肺移植模型【实验原理】 B16是C57BL/6小鼠耳根部皮肤上发现的自发性黑色素瘤,以后又在该瘤株中筛选出肺部高转移的集落株,小鼠静脉内移植后主要形成肺转移瘤,肺外转移极少。该瘤细胞注入静脉内,在短时间内直接把大量瘤细胞输入血液循环,不经过癌转移的前几个过程,故称为“人工转移”模型,以区别于“自发性转移”模型。该模型体现了肿瘤细胞进入血液循环后癌转移的几个步骤,对于研究肿瘤细胞在循环系统中的生成能力,瘤细胞附着、穿越靶器官血管的能力和探讨癌转移的器官特异性则有其独特的优势。【操作步骤】 取体外对数生长期的B16小鼠黑色素瘤细胞,经胰酶消化,以磷酸缓冲液配置成瘤细胞悬液,浓度为2.5*105/ml,,相应宿主尾静脉接种0.2ml/只。随机分组进行实验,3周后以颈椎脱臼法处死小鼠,称小鼠体重,剖取肺,称肺重,用解剖显微镜计数各肺叶的转移集落数,转移集落成黑色或灰黑色,相互间不融合。【结果计算】 计算给药组平均肺集落数与阴性对照组的平均肺集落数,计算肺转移抑制率。实验热线：19931682702（同微信）

细菌16S rDNA菌种鉴定16S rDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因。 长度约为1500pb,是细菌分类学研究中最常用、最有用的"分子钟16S rRNA其大小在1,500 bp左右,所代表的信息量适中,因此是进行分类研究的理想材料。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rRNA基因,并进行DNA测序,与GenBank中的已知序列进行同源性比较后,判定细菌种类,将细菌划分到属或种服务要求:1. 请提供基因组DNA、经菌种分离后带有单菌落的新鲜平板或斜面。2. 基因组DNA的浓度≥10 ng/μl,总体积≥20 μl,且无明显降解;平板或斜面应长有分离的单菌落。3. 由于革兰氏阳性细菌或厌氧菌、放线菌等特殊菌株,请在服务委托书中加以说明。4. 如果测序结果出现如下套峰,视为样品不纯,本公司将收取全额实验费用。并建议克隆多个测序鉴定。服务基本流程:1. 进行引物设计合成;2. PCR扩增16S rDNA;3. PCR产物纯化;4. 测序,序列比对分析。服务报告内容:实验报告包括PCR产物照片、NCBI序列比对鉴定结果、测序报告、序列碱基图、以及剩余模板(可保存1个月);16S rDAN是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的基因。 长度约为1500pb,是细菌分类学研究中最常用、最有用的"分子钟16S rRNA其大小在1,500 bp左右,所代表的信息量适中,因此是进行分类研究的理想材料。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rRNA基因,并进行DNA测序,与GenBank中的已知序列进行同源性比较后,判定细菌种类,将细菌划分到属或种实验热线：19931682702