限度法分析方法验证项目之我见

根据ICH Q2 分析方法验证：正文与方法学、《中国药典》2020年版 9101 分析方法验证指导原则要求，限度法分析方法需要进行的验证项目包括专属性、检测限、耐用性。

检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。检测限仅作为限度试验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。常用的方法如下：

1. 直观法

用已知浓度的被测物，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。

2. 信噪比法

用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠地检测出的被测物质最低浓度或量。一般以信噪比为3︰1时相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

3. 基于响应值标准偏差和标准曲线斜率法

按照LOD=3.3δ/S公式计算。式中LOD：检测限；δ：响应值的偏差；S：标准曲线的斜率。

δ可以通过下列方法测得：①测定空白值的标准偏差；②标准曲线的剩余标准偏差或是截距的标准偏差。

通过以上要求可知，对于检测限的验证一般均是采用对照品来进行，此时忽略了样品加标的响应情况，可能存在样品中加入限度浓度的对照品无法检出情况（例如回收率非常低的情况），难以证明待验证方法的科学性，因此笔者推荐按USP <1200> Requirements for Compendial Validation 的要求进行“可检测性”的验证。

可检测性验证需配制的溶液如下：

Ø 1:配制一个在限度浓度的杂质对照品溶液

Ø 2:配制一个在限度浓度的样品加标溶液

Ø 3:配制一个（限度100%-%RSD*浓度）的样品加标溶液

*RSD从Horwitz方程估算得出；RSD见图1

图1 浓度-RSD曲线

可接受标准：

如果1≤2 且 3<2，则差异可被检测出，否则，该方法不能胜任限度检测。

“可检测性”验证比较了对照品溶液、对照品加标溶液1和对照品加标溶液2的响应值，其实是变相的比较了回收率（非定量），从而保证了限度法分析方法的科学性。

该方法在USP<233> ELEMENTAL IMPURITIES—PROCEDURES的限度法验证中得到了应用，其验证要求如下：

l 溶液制备方法

Ø 标准溶液：制备目标浓度下待测元素的标准溶液。

Ø 样品加标溶液1：制备被试样品溶液，在目标浓度下加入待测元素的对照品溶液，溶解或消化同样品制备过程。

Ø 样品加标溶液2：制备被试样品溶液，加入目标元素浓度80%的待测元素的对照品溶液，溶解或消化同样品制备过程。

Ø 无标样品溶液：按样品溶液制备方法进行溶解或消化。

要求：加标样品溶液1的三次重复测量的平均值在标准溶液重复测量获得的平均值的±15%以内。加标样品溶液2的重复测量值的平均值应小于标准溶液的信号强度或值。【注：使用未加标样品溶液修正每个加标溶液的所得值。】

综上，限度法分析方法进行“可检测性”的验证更科学合理。