基因毒杂质羟胺的限度及检测方法

羟胺及其盐类常用作无数有机和无机反应中的还原剂。它们还可以作为脂肪酸的抗氧化剂；用于制备肟，一个重要的官能团。它也是生物硝化作用的中间体。

羟胺对呼吸系统、皮肤、眼部及黏膜具刺激性，吞食有害，为潜在的诱变剂。

据报道，盐酸羟胺在小鼠淋巴瘤 tk 突变测定中具有诱变性，有和没有代谢激活，但数据并不能令人信服地满足该测定中阳性结果的最新标准。认为羟胺通过具有阈值的作用方式（即脾含铁血黄素沉着症）诱导肿瘤。在血管肉瘤的 ≥ 5 ppm 或 0.2 mg/kg/天的雄性大鼠和高剂量 80 ppm 或 6.2 mg/kg/天的雌性大鼠（血管肉瘤和血管瘤）中观察到肿瘤增加。通过参考现有文献，ICH M7（R1） - 步骤-2得出结论，在 2 年大鼠研究中观察到的最低不良反应水平 （LOAEL） 为雄性 0.2 mg/kg/天，根据这个 NOEL 值，羟胺的终生 PDE 为 2μg/天。

文献已经报道了几种测定羟胺的分析技术。这些方法包括分光光度法、间接电位法、极谱法、液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法等。

《中国药典》 通则3209羟胺残留量测定法 系依据在碱性条件下，羟胺与碘反应生成亚硝酸，然后与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，再与“萘胺联形成有色的偶氮化合物，采用紫外-可见分光光度法(通则0401)测定羟胺的含量，但存在灵敏度低、干扰等问题，难以适用于低限度要求的检测。

因羟胺在气相、液相中响应均较低，因此多采用衍生化方法来提高灵敏度，其中气相法多用丙酮、环己酮生成酮肟等；液相、液质方法多采用苯甲醛、对硝基苯甲醛衍生。

典型的分析条件如下：

（1）气相方法：用环己酮将盐酸羟胺衍生为环己酮肟，通过气相色谱进行测定。色谱柱为安捷伦DB-624色谱柱（30 m×0.53 mm,3μm）；检测器为氢火焰离子化检测器（FID），检测器的温度260℃；进样口温度为230℃；高纯氮气为载气，恒流模式，流速为1.5 ml/min；色谱柱的升温程序为：起始温度55℃，维持2 min，以20℃/min的升温速率升温至95℃，维持2 min，再以40℃/min的升温速率升温至250℃，维持20 min。进样量为1μl；分流比为5:1。结果：盐酸羟胺在0.224 7～2.696μg/ml范围内，浓度与峰面积线性关系良好（r=0.999 7）；平均回收率为99.24%～106.59%之间，RSD为2.29%。[1]

（2）液质方法：采用反相色谱，经苯甲醛衍生后以水-乙腈（0.1％甲酸）为流动相，梯度洗脱，流速0.3mL/min， 以ESI正离子多反应监测（MRM）模式进行检测。结果：盐酸羟胺的检测限和定量限可分别达到0.2和0.4ng/mL，在线性范围内有良好的线性关系（r=0.9987），准确度实验低、中、高浓度回收率均在95.1%～ 109.2%，RSD为2.2%～6.4%，重复性实验６份加标样品溶液回收率的RSD为5.7%。[2]

（3）液相方法：HPLC 方法在 Sunfire C18 250 mm × 4.6 mm、5μm 色谱柱上开发和优化，柱温箱温度保持在 40°C。 选择磷酸盐缓冲液 （0.01M） pH 2.5 作为流动相 A，选择乙腈作为梯度反相模式的流动相 B。色谱参数，即流速：1.5 ml/min，波长：254 nm，进样体积：20μl 和运行时间：40 min。根据验证数据，发现该方法具有特异性、灵敏度、准确性和精密性。发现该杂质的既定检测限和定量限分别为 1.7μg/g 和 5.0μg/g。在非布司他原料药中羟胺的 12 次测定中，在 4 个水平上获得的平均回收率为 101.6%。[3]

我院基因毒杂质研究中心有多个原料药品种的羟胺残留分析方法研究经验，在文献方法基础上优化了衍生条件，增强了方法的耐用性和准确度。

参考文献

[1]李彬,李丽婉.气相色谱法测定非布司他原料药中的基因毒性杂质盐酸羟胺[J].天津药学, 2024, 36(2):18-21.

[2]樊华军. 高效液相色谱-串联质谱法检测替格瑞洛原料药中的盐酸羟胺[J]. 药物分析杂志, 2022, 42(4): 709-713 https://doi.org/10.16155/j.0254-1793.2022.04.19

[3]Ramana S V , Raja K D , Babu K ,et al.Determination of Hydroxylamine by HPLC, a Mutagenic Impurity in Febuxostat Drug Substance[J].  2018.