海藻糖在细胞冻存方面的应用（3）小鼠睾丸生精细胞冻存

前两期，我们分享了海藻糖用于人源少突胶质前体细胞（OPC）和脂肪来源干细胞冻存的相关研究，发现向冻存液中添加一定量海藻糖或使用海藻糖+甘油复合型冻存保护剂，可以提升干细胞长期冻存后的复苏活率，从而有助于后续将干细胞用于疾病治疗或创面修复等临床应用。本期，我们以小鼠睾丸生精细胞冻存为例，来探究一下海藻糖在辅助生殖领域的应用前景。不同冻存保护剂对未性成熟小鼠睾丸生精细胞冻存的影响

1. 睾丸生精细胞冻存背景

近些年，随着辅助生殖技术的快速发展，越来越多的患者生育后代成为了可能。在此过程中，生殖相关细胞的长期冻存成为了影响成功率的关键技术难点之一。例如，对于青春期前男性肿瘤患者，性腺毒性治疗可能会导致生育能力永久性丧失，睾丸组织或细胞低温长期冻存是保存其生育力的重要手段。然而对于全身性肿瘤患者，睾丸组织冷冻及复苏后自体移植会带来再次引入癌细胞的风险。考虑到睾丸细胞悬浮液可以进行分选清除癌细胞，而精原干细胞（SSC）可以在体外培养，诱导分化成圆形精子细胞，通过圆形精子细胞注射获得后代。因此，对于青春期前男性肿瘤患者，睾丸生精细胞的长期冻存是保存生育能力的重要途径之一，具有潜在的临床应用价值。来自郑州大学人民医院的张啸龙等研究人员，采用两周龄小鼠模拟人在青春期前未性成熟的睾丸发育状态，采用不同冻存方案对小鼠睾丸生精细胞进行低温冻存，探究最佳冷冻方案。

2. 不同冻存保护剂效果比较

该研究根据冻存液组分不同，分为以下5组：组别

采用两步酶解法制备小鼠睾丸生精细胞悬液，分装，分别加入5组冻存保护剂并转移至冻存管中。将冻存管进行程序化冷冻，2个月后从液氮中取出，复苏，检测细胞活率、凋亡率、线粒体膜电位等。

3. 实验结果

①冻存前后细胞活率及复苏率与冻存前比较，5组实验组细胞冻存复苏后活率均有所下降。其中E组细胞活率及复苏率显著高于其余4组。

②冻存后细胞恢复情况以每组4mg睾丸组织解离冻存后实际回收的活细胞数，对睾丸细胞冻存复苏后进行定量计算。结果显示E组细胞恢复数量显著高于其他4组。

③细胞凋亡率流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果显示，与对照组相比，各实验组细胞凋亡率均显著增加。5组实验组中，E组细胞凋亡率显著低于其余4组。

④线粒体膜电位与对照组相比，冻存复苏后5组实验组细胞线粒体膜电位均显著下降，其中E组下降程度最低，显著低于其余4组。

4. 讨论

冷冻保护剂可分为渗透性保护剂和非渗透性保护剂，非渗透性保护剂中，最常用的是蔗糖和海藻糖。此前有研究显示，向冷冻保护剂中添加蔗糖或海藻糖，可显著提高恒河猴或小鼠的睾丸细胞复苏活率。该研究结果显示，冷冻保护剂中添加0.1mol/L蔗糖或0.1mol/L海藻糖对细胞低温冷冻均具有一定的保护作用，而同时添加0.1mol/L蔗糖和0.1mol/L海藻糖可显著提高小鼠睾丸生精细胞冷冻复苏后的活率，降低细胞凋亡率，并降低低温冻存对细胞线粒体膜电位的损伤。但较高的DMSO浓度（15%）产生的细胞毒性会部分抵消蔗糖和海藻糖的冷冻保护作用。